NR6A1基因启动子的克隆及其在氧化损伤中的转录调控分析

发布时间：2020-08-08 11:55

【摘要】：NR6A1是核受体亚家族6成员1,其配体未知,属于孤儿核受体,又称生殖细胞核因子。已有的研究表明,NR6A1在发育中的胎盘、神经系统、成年人类和动物睾丸、卵巢及大多数肿瘤组织中均有表达,其功能主要涉及细胞分化、发育和肿瘤的形成,但其转录调控方面的分子机制尚不清楚。本研究首先分别克隆了人及小鼠NR6A1基因启动子的全长及各截短序列。随后,分别构建了 NR6A1基因启动子全长及不同截短序列的荧光素酶报告基因表达体系,并分别转染永生化小鼠B型精原细胞GC-1、正常小鼠睾丸Sertoli细胞TM4、人睾丸畸胎瘤细胞NT-2和人胚肾细胞293等细胞系,检测各启动子片段的转录活性。实验结果显示,鼠源Nr6a1基因启动子的核心区域位于-169bp～+78bp处;人源NR6A1基因启动子的核心区域位于-280 bp～+168 bp处,它们均具有最强的转录活性。生物信息学分析显示,SP1、KLF5、KLF4、CREB1、E2F6和Mafb等6个转录因子结合位点是人、鼠Nr6a1核心启动子区共有的,已知SP1、KLF5和KLF4同属于KLF家族成员,而6个不同转录因子中有3种是KLF家族因子,同时还发现两个启动子区都富集SP1结合位点,提示转录因子SP1对NR6A1的转录调控具有重要作用。进一步利用SP1 ORF表达载体,再结合荧光素酶报告基因实验发现,在TM4、GC-1和293细胞系中,NR6A1启动子区在SP1的作用下活性均增强,且发现不同片段的启动子区活性与SP1结合位点的个数无关,并无叠加效应。同时,利用SP1的si-RNA干扰序列,在293和NT-2细胞系中验证了敲低SP1后,NR6A1启动子活性下降。这些实验证实了 SP1对NR6A1启动子的转录活性具有正向调控作用。此外还发现启动子区靠近起始密码子的SP1结合位点发挥的转录调控作用可能比远端的更强一些。最后,本研究探讨了 SP1在NR6A1响应氧化损伤过程中的调控作用。以H2O2为氧化剂,建立了 NT-2细胞氧化损伤模型。用0～70μM的H202处理细胞12h,细胞形态学观察、生化检测等方法显示,随着H202浓度的升高,细胞由圆润饱满逐渐变的皱缩扁平,逐渐失去接触,生长受到抑制,细胞超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活力降低,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量减少,而脂质氧化产物(Malondialdehyde,MDA)的含量上升,说明H202对细胞造成了氧化损伤。在此基础上,采用定量PCR和Western Blot技术分析发现,在H202的作用下,SP1和NR6A1的mRNA和蛋白表达水平均明显上调。结合荧光素酶报告基因实验,进一步验证了 NR6A1基因启动子区全长和截短片段的活性在H202作用下显著增强,提示了在氧化应激下NR6A1基因的表达与其启动子活性密切相关。当利用si-RNA干扰序列敲低NT-2细胞氧化损伤模型中的SP1基因之后,通过RT-qPCR方法发现NR6A1基因在mRNA水平的表达也随之减少,说明SP1参与了 NR6A1基因对H202损伤信号的响应。综上,本研究克隆了人及小鼠NR6A1基因启动子序列,确定了其核心启动子区域,证实了 SP1对NR6A1启动子转录活性具有正调控作用,且NR6A1可能通过SP1应答氧化损伤信号。这些研究结果为阐述NR6A1基因的转录调控机制奠定了基础。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

第１章绪论逡逑１真核基因的转录调控逡逑在真核生物中，从ＤＮＡ转录成ＲＮＡ对于启动基因表达调控是一个最重要究过程。自从２００６年诺贝尔化学奖授予Ｒｏｇｅｒ邋Ｄ．Ｋｏｒｎｂｅｒｇ［１］以表彰他在“真胞转录分子基础方面的研宄”以来，最近几年，科学家们将其研宄重点放在启动子区的顺式作用元件和转录因子及其转录调控机制方面，这是研究一个的结构及其功能的基础，也是未来生物学界研究的热门话题之一［２］。逡逑真核生物的基因编码区是不连续的，由外显子和内含子间隔排列，上游５＇有启动子、增强子、沉默子、转录起始位点等，下游３＇端含有终止子。ＤＮ录的初产物必须经过剪接，去除内含子序列；可变剪接是指同一个基因序列，逡逑能会形成不同的成熟ｍＲＮＡ，最终对应不同的蛋白质产物（如图１．１）。逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逦ｐｏｌｙ－Ａ逡逑

含有启动子、增强子、沉默子、转录起始位点等，下游３＇端含有终止子。ＤＮＡ逡逑转录的初产物必须经过剪接，去除内含子序列；可变剪接是指同一个基因序列，逡逑可能会形成不同的成熟ｍＲＮＡ，最终对应不同的蛋白质产物（如图１．１）。逡逑Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逦ｐｏｌｙ－Ａ逡逑ｓｔａｒｔ逦Ｔｒａｎｓａｉｐｔｉｏｎ逦、逦ｓｉｔｅ逡逑１逦＊逦Ｉ邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｓｔｏｐｓ逡逑＂ＡＴＧ邋ｉｎｌｒｏｎ邋１邋ｉｎｔｒｏｎ邋２邋ｉｎｔｒｏｎ邋３邋ｉｎｔｒｏｎ邋Ａ逦ｉｎｉｒｏｎ５邋ＴＡＡ邋ｔ邋｜邋｜邋＾逡逑ｄ邋ｉｎ邋ｙ，邋ｎ邋■邋ｉ邋ｉ邋＼逦ｎ邋ｎ逦ｆ逦＼邋ｆ邋ｊ逦ｉ逦%煎

本文编号：2785528