百脉根组蛋白去乙酰化酶基因LjHDT2对AM真菌共生调节的影响
发布时间：2020-08-08 15:22
【摘要】：丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi,AMF)作为一种专性共生真菌,可与地球上90%的维管束植物形成共生复合体。研究表明,百脉根作为重要的模式豆科植物,可与AMF形成共生互惠关系,不仅可增强植株的抗逆性,在农林牧上也具有很好的应用价值。大量研究报道,组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)可影响组蛋白末端氨基残基上的分子基团的修饰,并能调控下游基因的表达水平。当前,对此类基因的研究是集中在水稻、拟南芥等的生长发育相关领域,而对如何调节植物与微生物之间的共生信号转导途径鲜有报道。因此,本研究基于生物信息学技术,筛选编码百脉根LjHDAC基因,qRT-PCR分析发现LjHDT2可被AMF显著诱导表达,为进一步分析该基因敲除后对AMF共生的影响,本研究利用RNAi技术建立了LjHDT2-RNAi转基因百脉根,通过对AMF侵染效率的分析,初步揭示了该基因在百脉根与AMF共生体系中的作用,主要实验结果如下所示:1.百脉根的组蛋白去乙酰化酶基因家族分析表明,目的基因为组蛋白去乙酰化酶HD2家族成员。qRT-PCR结果表明,AMF显著诱导百脉根根系中的一个LjHDT基因的表达水平。序列同源比对发现,该基因与苜蓿HD2家族的MtHDT2具有非常高的相似性,故将该基因命名为LjHDT2。2.序列分析表明LjHDT2基因全长为1156bp,编码297个氨基酸,其编码蛋白的相对分子质量为32.12 kD,等电点为4.88。LjHDT2蛋白的亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位在细胞核中。3.构建了LjHDT2-RNAi干涉重组载体,借助发根农杆菌成功将重组质粒导入百脉根植株的根系中,获得了LjHDT2-RNAi转基因百脉根,定量PCR分析转基因的根系中LjHDT2基因表达水平,发现该基因被显著下调。4.与AMF互作分析发现,沉默LjHDT2后的转基因百脉根中AMF定殖所需时间变长,约需20-25天建立稳定的共生关系并产孢;而对照植株需要15-20天。并且发现,转基因百脉根中AMF定殖率下降,形成孢子的数目也有显著的存差异,在侵染15-30天后,AMF的定殖效率是16.67%-33.05%;而在野生型百脉根中是23.50%-44.44%,且其20天时AMF定殖率与转基因百脉根30天的AMF定殖率无显著差异。我们也发现,野生型植株和LjHDT2-RNAi转基因植株根系数目并无显著差异(p0.05)。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q93;Q943.2
【图文】：
AMF 可与植物进行识别并形成共生复合体[25-26]，但 AMF 必须依赖于植物根系胞生的建立，才能从植株内获取营养并完成自身的生命周期与下一代的产孢。AMF活史一般有三个阶段[27]：①建立预共生和共生体阶段(孢子的激活、与宿主的识丛枝形成、对根系进行定殖)；②是营养生长阶段(菌丝大范围的分化以及延伸)；生殖生长阶段(无性生殖并进行下一代产孢，完成一个生活周期)。但是 AMF 是无性生殖的一种微生物，其营养生长与生殖生长的分割线并不清晰，通常第二和阶段是同时发生的。后来 Ike-Izundu 等经过归纳[28]，将这种微生物的生活史分为生阶段、预共生阶段和共生阶段三个阶段。如图 1 所示，孢子感应到根系的信号始萌发，待伸出菌丝后对对根系表皮进行侵染，菌丝深入细胞间隙进行延伸分化，株中获取营养后在细胞内生长发育形成丛枝结构等，从而完成共生，最后进行产进行下一轮生活周期。
酰化酶的基本介绍念进行去乙酰化修饰的酶即组蛋白去乙酰化酶(His除去组蛋白末端氨基残基上的分子基团，它对基因组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)是组成核小体的必能够影响基因水平上的调控。组蛋白的修饰翻译去乙酰化修饰后，其结构由于基团的变化也发生类 1996 年克隆了史上第一个去乙酰化酶 HDT1[67]，得到的，紧接着，真菌、鸡、大鼠、人，和拟南芥鉴定出来。现今主要将 HDAC 分为三大类：RPD3综合近些年关于此种酶类的研究与归纳，并以比酶为主，进行植物去乙酰化酶家族分析，结果如
4 结果与分析4.1 AMF 与百脉根共生体系的建立4.1.1 G. intraradice 孢子的分离与筛选孢子生长情况如图所示(图 3-1)，从培育 G. intraradice 孢子的 MSR 板子上将 G.intraradice 孢子清洗下来，进行过滤筛选，最后将孢子悬浮液都收集在容器中，显微镜下观察检测。那么从图 B 中，可以看到孢子本身发黑，偏瘦小，说明该孢子活性不高，且有衰败迹象，不适合与百脉根共生。而图 A 中，我们可以发现，清洗下来的孢子整体呈丰满的圆球状，颜色金黄，而且孢子存在多个菌丝触发点，活性很高，具备与百脉根进行共生的先决条件。本实验以 A 图中这样条件的孢子与百脉根进行共生。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q93;Q943.2
【图文】：
AMF 可与植物进行识别并形成共生复合体[25-26]，但 AMF 必须依赖于植物根系胞生的建立，才能从植株内获取营养并完成自身的生命周期与下一代的产孢。AMF活史一般有三个阶段[27]：①建立预共生和共生体阶段(孢子的激活、与宿主的识丛枝形成、对根系进行定殖)；②是营养生长阶段(菌丝大范围的分化以及延伸)；生殖生长阶段(无性生殖并进行下一代产孢，完成一个生活周期)。但是 AMF 是无性生殖的一种微生物，其营养生长与生殖生长的分割线并不清晰，通常第二和阶段是同时发生的。后来 Ike-Izundu 等经过归纳[28]，将这种微生物的生活史分为生阶段、预共生阶段和共生阶段三个阶段。如图 1 所示，孢子感应到根系的信号始萌发，待伸出菌丝后对对根系表皮进行侵染，菌丝深入细胞间隙进行延伸分化，株中获取营养后在细胞内生长发育形成丛枝结构等，从而完成共生，最后进行产进行下一轮生活周期。
酰化酶的基本介绍念进行去乙酰化修饰的酶即组蛋白去乙酰化酶(His除去组蛋白末端氨基残基上的分子基团，它对基因组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)是组成核小体的必能够影响基因水平上的调控。组蛋白的修饰翻译去乙酰化修饰后，其结构由于基团的变化也发生类 1996 年克隆了史上第一个去乙酰化酶 HDT1[67]，得到的，紧接着，真菌、鸡、大鼠、人，和拟南芥鉴定出来。现今主要将 HDAC 分为三大类：RPD3综合近些年关于此种酶类的研究与归纳，并以比酶为主，进行植物去乙酰化酶家族分析，结果如
4 结果与分析4.1 AMF 与百脉根共生体系的建立4.1.1 G. intraradice 孢子的分离与筛选孢子生长情况如图所示(图 3-1)，从培育 G. intraradice 孢子的 MSR 板子上将 G.intraradice 孢子清洗下来，进行过滤筛选，最后将孢子悬浮液都收集在容器中，显微镜下观察检测。那么从图 B 中，可以看到孢子本身发黑，偏瘦小，说明该孢子活性不高，且有衰败迹象，不适合与百脉根共生。而图 A 中，我们可以发现，清洗下来的孢子整体呈丰满的圆球状，颜色金黄，而且孢子存在多个菌丝触发点，活性很高，具备与百脉根进行共生的先决条件。本实验以 A 图中这样条件的孢子与百脉根进行共生。
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 盛萍萍;王彬;苑学霞;王小s
本文编号：2785739
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