小麦脱水素WZY2基因启动子互作蛋白的筛选及鉴定

发布时间：2020-08-09 09:25

【摘要】：脱水素是一类逆境胁迫响应蛋白,在植物生长发育中起着重要作用。当植物遭受低温、干旱、高温和高盐等非生物胁迫时,可以产生高度亲水性蛋白质,对细胞核酸、胞内蛋白和膜结构具有特定的保护作用,对于稳定细胞膜系统和许多大分子的结构发挥作用。脱水素的高表达可以提高植物的抗逆性。对研究作物抗逆机制有重要意义。本文以小麦“郑引1号”品种为材料,克隆获得脱水素WZY2启动子,构建脱水素WZY2基因启动子的原核克隆载体(重组菌pAbAi-WZY2)。利用同源重组方法,构建酵母诱饵载体(重组菌Y1H-pAbAi-WZY2),对其进行自激活验证,从小麦cDNA文库中筛选鉴定与其互作的转录因子,并对其特性进行分析和预测。利用实时定量PCR方法,分析了在逆境胁迫下该转录因子的表达水平。研究表明,脱水素WZY2基因启动子序列全长为633 bp(不含ATG),基因启动子含有逆境相关的顺式作用元件,即ABA响应元件(ABREs)、厌氧特异性诱导元件(GC-motifs)、低温响应元件(LTREs)、茉莉酸甲酯响应元件(TGACG motifs);与光响应相关的元件有,AT1 motifs、G-boxes、GATA motifs、TGG motifs。确定酵母诱饵载体的背景表达水平,从小麦cDNA文库中筛选出17个转录因子。通过反式激活验证,有3个转录因子可以与启动子WZY2的作用元件互作,分别是bHLH49-like(351)、Zincfinger A20/AN1(407)、bHLH47-like(467)。转录因子预测表明,bHLH49-like(351)基因的CDS序列长为783 bp,编码260个氨基酸,相对分子量为28.85 ku,理论等电点7.78。AN1-like Zinc finger(407)基因的CDS序列长为486 bp,编码161个氨基酸,相对分子量为17.74ku,理论等电点8.51。bHLH47-like(467)基因的CDS序列长为780 bp,编码259个氨基酸,相对分子量为29.15 ku,理论等电点6.62。这些转录因子均为高度亲水蛋白。实时定量PCR结果表明,WZY2在不同胁迫下,其表达量有上调趋势。筛选得到3个作用于WZY2启动子的转录因子,亦均呈现上调趋势,暗示WZY2表达可能受到这些转录因子的调控,但结果还需进一步验证。bHLH49-like(351)、AN1-like Zinc finger(407)、WZY2均响应PEG、ABA和低温胁迫,属于ABA依赖型;但bHLH47-like(467)只响应低温胁迫,属于非ABA依赖型转录因子。研究表明,小麦脱水素WZY2基因启动子可以与相关的转录因子结合,从而激活下游报告基因的表达,实现对抗逆机制网络的调控。该研究为小麦耐旱的基因调控奠定了理论基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2
【图文】：

载体pAbAi上的报告基因。当猎物蛋白与诱饵菌株结合时，GAL4 AD激活AbAr的表达，使得细胞可以在含有AbA抗生素的培养基上生长(如下图)。图1.5 酵母单杂交筛选DNA-蛋白互作的原理Fig1.5 Basic principle of screening for protein-DNA interactions with yeast one hybrid如果单杂交系统中内源转录因子可以识别诱饵序列，将造成很高的本底表达水平，因此在筛选 cNDA 文库前要进行严格的自激活性的验证。该体系不仅可以筛选转录因子，而且在细胞信号转导以及基因调控等方面也有重要作用(王琪等 2008)。目前，单杂交系统有了更为广泛地应用，能够确定转录因子与顺式作用元件的相互作用。以此为前提，对 DNA 结合蛋白进行体内体外的验证，并对其进行生理功能方面的研究。在生物合成基因的转录调控水平上，有学者在研究石竹科植物时发现，牵牛花(Petunia hybruda)中调控花青素合成的 AN2 (PhAN2)和 JAF13 (PhJAF13)转录因子能与菠菜(spinacia oleracea)种子特异表达的 2 个基因 DFR (Dihydroflavonol 4-reductase)、ANs(Anthocyanidin synthase)的启动子顺式作用区域发生相互作用(Shimada et al. 2007)。Ren

第三章 结果与分析3.1 脱水素 WZY2 基因启动子的生物信息学分析基于 PlantCARE database，对 WZY2 启动子元件进行预测分析，序列中不仅包本元件，如 TATA-box 和 CAAT-box，与真核生物 RNA 聚合酶 II 识别和转录起始有关；还含有与逆境相关的顺式作用元件，如 ABRE、LTRE 等 (图 1)。根据顺式元件的潜在响应功能，可将其分为：(1) proWZY2 中与非生物胁迫相关：ABA 响应(ABA-responsive elements, ABREs) 、厌氧特异性诱导元件 (anoxic specific inducelement, GC-motifs)、低温响应元件(low temperature-responsive elements, LTREs)；生物胁迫相关：生长素响应元件(auxin-responsive elements, TGA elements)、茉莉酸响应元件(MeJA-responsive elements, TGACG-motifs)、赤霉素响应元件(gibbRespon-sive elements，TATC boxes)；(3) 与光响应相关：AT1 motifs、G-boxes、Gmotifs、TGG motifs；(4) 与种子生长发育相关：胚乳特异性表达元件(endosperm-sexpression elements，Skn-1motifs)。

CACGTA/tgACACGTGGCA/CACGTC/CAGACGTGGCA参与光CCCCCG 参与缺子元件GTCAT 参与胚TAATA/TATAAAT/TATA/ccTATAAATT核心启TATCCCA 参与赤TGACG 响应 MCGTGG体的构建增 基因启动子的序列，设计引物 Fa PCR 扩增，获得 633 bp (不含 ATp 相吻合，说明 PCR 条件合适且成

【参考文献】

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1 强治全;梁雅s

本文编号：2786926