StPOTHR1基因在马铃薯晚疫病抗性中的功能解析

发布时间：2020-08-09 11:38

【摘要】：马铃薯(Solanumtuberosum L.)是全球继小麦、水稻、玉米之后的第四大粮食作物,由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是马铃薯生产中最为严重的病害。马铃薯进化出两个分支的免疫反应来应对晚疫病原菌的侵染,包括由病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)激发的 PTI(PAMPs triggered immunity)和由效应子(Effector)引起的 ETI(Effecter triggered immunity),激发一系列抗病反应相关基因来抵抗病原菌的侵染,有时会诱导产生过敏性坏死反应(Hypersensitive response,HR)来抑制病原菌的进一步扩展。本实验室前期克隆到了一个可能与过敏性反应相关的基因StPOTHR1,该基因受晚疫病原菌、机械伤害、盐胁迫和茉莉酸诱导表达,但在马铃薯晚疫病抗性上的作用机制及其与HR的关系尚不明确。本课题研究了StPOTHR 与HR的关系、在晚疫病抗病反应中的作用机制及其介导的免疫信号途径,为马铃薯晚疫病持久抗性育种研究提供了新的思路及潜在的基因资源。主要研究结果如下:1.获得了可以高丰度组成型稳定表达GFP且具有与野生型菌株致病力相当的转基因P.infestans菌株W8-G20,为定性和定量研究马铃薯与晚疫病原菌互作机制提供了直观和简便的技术手段;利用W8-G20接种马铃薯晚疫病水平抗性基因型386209.10和感病基因型鄂马铃薯1号(E1),能够清晰的观察到两个基因型表现出明显不同的发病症状,E1叶片上的荧光强度显著高于386209.10,386209.10可以显著地抑制病原菌的增殖速度,说明抑制病原菌在体内的定殖和扩展可能是水平抗性的一个重要防御机制。2.通过生物信息学分析发现StPOTHR1含有NHL(NDR/HIN1-like)家族的3个保守结构域,属于NHL家族成员。通过系统进化树分析进一步发现,其与NHL基因家族成员NtHIN1和AtNHL3亲缘关系最近,推测其与植物的过敏性反应、抗病性等生物学过程相关。原位杂交(ISH)和qRT-PCR实验表明,在垂直抗性基因型鄂马铃薯3号(E3)与晚疫病致病菌株W8互作产生HR的过程中,StPOTHR1只在过敏性病斑部位大量表达,而在其他位置几乎不能诱导表达,表明StPOTHR1的表达与HR紧密相关,可能是马铃薯抗病反应中的起重要作用的基因。3.通过研究StPOTHR1在马铃薯对晚疫病在亲和互作(感病)、非亲和互作(垂直抗性)以及水平抗性(小种非特异抗性)过程的表达模式,发现StPOTHR1在垂直抗性基因型E3中能迅速响应,并维持在较高的表达水平;而在感病基因型E1中则一直维持在较低的水平,只在后期有上调表达的趋势;在水平抗性基因型386209.10中,表达水平处于则前两者之间。研究结果表明,StPOTHR1基因的表达量与马铃薯的抗性反应发生的强度呈正相关。4.在感病基因型E1中超量表达StPOTHR1,能显著抑制病原菌孢子囊的数量,显著提高植株对晚疫病的抗性,表现出与水平抗性基因型386209.10相似的抗性特征,但在垂直抗性基因型E3中,抑制StPOTHR1的表达不能抑制HR的产生;同时,在本氏烟草(Nicotianabenthamian)中瞬时沉默StPOTHR1的同源基因NbPOTHR1后,不会影响由主效 R/Avr基因(Sto/Ipio、Rvnt-1/Avrvnt-1、Pto/AvrPto、Cf4/Avr4、Cf9/Avr9和R3a/Avr3a)等介导产生的HR,说明StPOTHR1介导的抗性反应可能独立上述己知的R/Avr介导的HR。5.研究主效 R/Avr 基因对(Sto/Ipio、Rvnt-1/Avrvnt-1、Pto/AvrPto、Cf4/Avr4、Cf9/Avr9和R3a/Avr3a)介导的HR过程中POTHR1的表达模式发现,POTHR1只响应特异的R/Avr基因对(Pto/AvrPto)介导的HR;同时其也受到能激活PTI的晚疫病原菌效应子INF1和细菌PAMPs flg22的诱导,并且POTHR1也能调控PTI早期响应marker基因的表达,表明POTHR1可能参与了 PTI和ETI的crosstalk。6.在烟草上瞬时表达GFP-StPOTHR1融合表达载体,发现GFP-StPOTHR1定位于细胞膜上,通过Western Blot证明了该蛋白的完整性,说明GFP-StPOTHR1的定位能准确反应StPOTHR1在植物体内执行功能的位置;同时,我们还发现GFP-StPOTHR1的实际电泳条带大于其理论值,其可能是翻译后修饰所导致,通过利用LC-MS/MS技术,对StPOTHR1的翻译后修饰进行了探究,结果发现StPOTHR1受到多种翻译后修饰调控,GFP-StPOTHR1条带的迁移可能与这些翻译后修饰相关。本研究首次全面地探究了 NHL家族成员StPOTHR1的翻译后修饰位点,对这些位点潜在功能的探究将进一步增强对植物免疫调控的认识。7.通过利用IP-LC-MS/MS分析,筛选到一个植物MAPK级联途径上的可能与StPOTHR1互作的组分NbMKK5L,进一步通过Co-IP确证了 NbMKK5L与StPOTHR1的直接互作,该结果暗示过表达StPOTHR1导致的马铃薯晚疫病抗性的增强可能与激活植物免疫相关的MAPK级联途径相关;本研究构建了StPOTHR1基因原核表达载体并在体外获得了大量纯化活性蛋白,为体外进一步直接研究MKK5L与StPOTHR1间的调控作用,如MKK5L能否直接将StPOTHR1磷酸化等研究提供了基础。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.32
【图文】：

模型图,模型,病原菌,协同进化

．．随着人们对植物和病原菌互作研究的不断深入，更多新的理论被提出，最被接受和认可的是Ｚｉｇｚａｇ模型假说。Ｚｉｇｚａｇ理论认为：病原菌本身具有某些保守，即病原相关分子模式（Ｐａｔｈｏｇｅｎ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｐａｔｔｅｒｎ，ＰＡＭＰｓ），在长期与病原菌协同进化过程中，植物进化出可以识别这些保守物质的受体蛋白，这别反应可以诱导植物产生防御反应（ＰＴＩ，邋ＰＡＭＰｓ邋ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ）邋（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｎｄ邋Ｊａｎｅｗａｙ邋１９９７，邋Ｂｒｕｎｎｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００２，邋Ｊｏｎｅｓ邋ａｎｄ邋Ｄａｎｇｌ邋２００６，邋Ｂｅｎｔ邋ＡＦ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）（）；而病原菌进化产生的效应子（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）能有效地抑制ＰＴＩ（Ｚｉｐｆｅｌ邋２００８，邋Ｄｏｄｄｓ邋ａｎａｔｈｊｅｎ邋２０１０）；接着植物又进化出能够识别Ｅｆｆｅｃｔｏｒ的受体蛋白，进而诱导了邋ＥＴ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｔｒｉｇｇｅｒ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ），ＥＴＩ抗性强度更剧烈，更能有效阻止病原菌的侵染展，这种级联反应使病原菌与宿主植物之间断相互影响并协同进化（Ｎｉｉｍｂｅｒｇｅｒ邋ｅｌ邋２００４邋）0逡逑

游动孢子,晚疫病

为了更直观地观察晚疫病菌对马铃薯的侵染情况，用载体Ｐ３４ＧＦＮ转化Ｐ．逡逑菌株Ｗ８以获得ＧＦＰ标记的病原菌。按２．２．１章节中的方法获得并纯化了逡逑大量的游动孢子（图３ａ和图３ｂ），作为受体进行电击转化，在抗性培养基上进行筛逡逑选，共得到２５个阳性转化子（图４），分别命名为Ｗ８－ｐ３４ＧＦＮｌ－２５。逡逑ｔ．逦ｂ逡逑．容▲邋＇逦．？国逡逑，逦／－＾＾Ｈ＾＾３３％ｐｅｒｃ0＂逡逑、逦％邋－邋？逦４逦＂■邋？邋．邋ｙ；．邋＂逦Ｐ．邋Ｉｎｆｅｓｔａｎｓ逡逑？耱？＃逦ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ逡逑■邋？逦Ｖ邋？－？邋＂逦Ｐ，邋Ｖ：：逦；｜ｌ３３？Ｐｅｒｃｏｌｌ逡逑＾邋＼０邋逦逡逑图３晚疫病原菌游动孢子诱导、分离与纯化逡逑（ａ）诱导释放游动孢子；（ｂ）分离、纯化游动孢子。逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，邋ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｉｎｆｅｓｔａｎｓ邋ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ逡逑（ａ）邋Ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ；邋（ｂ）邋Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｚｏｏｓｐｏｒｅｓ．逡逑３７逡逑

晚疫病菌,转基因,遗传稳定性,野生型

光蛋白（ＧＦＰ）能否在Ｗ８－Ｇ２０菌株内稳定遗传。将继代培养１０次的菌株Ｗ８－Ｇ２０，逡逑洗脱，荧光显微镜镜检。结果显示，Ｗ８－Ｇ２０菌株的菌丝和孢子囊均释放较强的绿逡逑色荧光（图６ａ），说明ＧＦＰ基因在菌株Ｗ８－Ｇ２０内可以稳定遗传。逡逑为了验证Ｗ８－Ｇ２０是否具有致病力，将继代１０次Ｗ８－Ｇ２０菌株和野生型Ｗ８逡逑菌株进行活化，在炓麦培养基上培养２周、洗脱病原菌、诱导产生游动孢子后，分逡逑别离体接种马铃薯感病基因型鄂马铃薯１号（Ｅ１）的叶片，接种同样剂量清水的逡逑Ｅ１叶片作为阴性对照。接种４天后，接种Ｗ８－Ｇ２０的叶片都受到了晚疫病原菌的侵逡逑染，晚疫病菌丝在Ｅ１叶片迅速生长，接种叶片出现了明显感病的状态，与接种野逡逑生型Ｗ８的Ｅ１叶片没有明显的区别，而清水对照则无感病现象出现（图６ｂ）；用激逡逑光共聚焦显微镜观察（激发光波长为４８８邋ｎｍ）荧光标记病原菌Ｗ８－Ｇ２０在Ｅ１叶片逡逑上的侵染情况

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