大丽轮枝菌VdDfs基因簇调控寄主落叶性状的分子机制研究

发布时间：2020-08-09 22:06

【摘要】：大丽轮枝菌是典型的土传维管束病原真菌,无性繁殖但具有丰富的种群多样性。根据其侵染寄主(棉花、秋葵等)的病症特点,大丽轮枝菌分为落叶和非落叶两种致病型。落叶型菌株因其对寄主的强致病力和优势适应性而在世界范围内广泛流行;在我国主产棉区,落叶型大丽轮枝菌已成为黄萎病的优势种群,但大丽轮枝菌引起寄主落叶/非落叶性状分化的遗传学基础一直不清楚。本实验室前期比较基因组学分析发现棉花高致病型大丽轮枝菌Vd991相对于莴苣和番茄来源的大丽轮枝菌Vd Ls.17和JR2存在一个基因组特异区段G-LSR2,该片段中7个基因(Vd Df1-Vd Df7,Vd Dfs)通过水平转移从枯萎病菌中获得,调控大丽轮枝菌对寄主棉花的优势适应性。在此基础上,通过对来源于我国不同主产棉区的75株大丽轮枝菌(其中包括59株落叶型菌株、16株非落叶型菌株)群体重测序和基因组比较分析发现,Vd Dfs仅存在于落叶型大丽轮枝菌,在非落叶菌株中完全缺失;7个基因共敲除后,ΔDfs丧失了引起寄主落叶的能力,表明这7个基因具有引起寄主落叶性状的功能。基因表达分析表明7个基因特异应答对棉花的侵染,在侵染早期显著上调表达,尤其是Vd Df5和Vd Df6两个基因在侵染48h被诱导超高表达;利用同源重组获得了上述7个基因的单基因敲除突变株,落叶表型鉴定显示只有ΔDf5和ΔDf6缺失突变株丧失了引起棉花落叶表型的能力;回补双基因Vd Df5_6至ΔDfs突变株和棉花来源的非落叶型大丽轮枝菌VDG78后,转化菌株均能引起棉花落叶表型;以上结果表明Vd Df5和Vd Df6是调控落叶表型的关键功能基因。前期遗传进化分析表明,7个基因从尖孢镰刀菌中水平转移获得,序列比对结果显示这7个基因虽然与尖孢镰刀菌中同源基因序列相似性非常高,仍存在显著的多态性位点;其中基因Vd Df5存在三个无义突变位点,Vd Df6除了存在18bp的碱基截断导致编码序列重新起始外还存在四个无义突变位点;将上述两个尖孢镰刀菌中的同源基因异源共回补到非落叶大丽轮枝菌VDG78中未能引起寄主棉花的落叶表型;以上结果表明Vd Df5和Vd Df6从尖孢镰刀菌水平转移获得后经历了选择进化,从而赋予大丽轮枝菌引起寄主棉花落叶的功能。通过对ΔDfs缺失突变体和野生型菌株Vd991在侵染棉花48h的表达谱分析发现,氧化还原酶基因VEDA_05052受Vd Dfs基因簇显著调控;该基因在Vd991侵染棉花早期被诱导超高表达,而在缺失突变株ΔDfs,ΔDf5_6以及非落叶型菌株VDG78的侵染过程基本不表达;该基因编码乙醇脱氢酶,命名为Vd DH1,落叶功能鉴定显示Vd DH1过表达至ΔDfs缺失突变体和ΔDf5_6共敲突变体后均能恢复其落叶表型,表明Vd Dfs基因簇协同Vd DH1赋予大丽轮枝菌引起寄主落叶功能;缺失突变株ΔDfs,ΔDf5_6和ΔDH1在微氧胁迫条件下的生长表型鉴定结果显示,其孢子萌发和菌丝产孢能力均显著下降;透射电镜观察结果显示上述三个突变体穿透棉花皮层进入维管束的能力显著下降,无法到达维管束;以上实验表明调控落叶表型的关键功能基因Vd Df5和Vd Df6及其协同基因Vd DH1在大丽轮枝菌应对寄主维管束的微氧胁迫中发挥重要作用,促进大丽轮枝菌对寄主棉花维管束微氧胁迫环境的适应,最终引起寄主落叶表型。对G-LSR2编码的22个基因进行功能注释,其中基因Vd Df5和Vd Df6编码聚酮合成酶,Vd Df7编码N-磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D(NAPE-PLD),Vd Df4编码MFS转运蛋白,呈现典型的次级代谢基因簇特性;突变菌株ΔDfs和其回补菌株EC-Df5_6(ΔDfs)的次级代谢产物处理棉花幼苗结果显示,ΔDfs次级代谢组分丧失引起棉花叶片脱落的能力;基因注释表明,Vd Df7编码NAPE-PLD,分解NAPE产生NAE;定量分析发现缺失突变体ΔDfs中NAE12:0含量显著低于野生型,Vd Df5_6共回补突变体ΔDfs和非落叶型菌株VDG78后可恢复高水平NAE12:0浓度;大丽轮枝菌群体分析结果显示,非落叶型菌株中NAE12:0浓度显著低于落叶型菌株,在非落叶菌株接种棉花幼苗的基础上,叠加体外施用NAE12:0,导致棉花落叶表型;过量的NAE12:0导致寄主棉花体内FAAHs过量表达,进而引起寄主对脱落酸更加敏感以及体内激素失衡最终导致寄主落叶;以上结果表明,基因簇Vd Dfs通过参与大丽轮枝菌次生代谢物NAE12:0的合成进而影响大丽轮枝菌对寄主落叶性状的调节。综上所述:基因簇Vd Dfs经过选择进化由镰刀菌水平转移而来,广泛存在于落叶型大丽轮枝菌中,该基因簇通过协同关键乙醇脱氢酶基因Vd DH1在应对寄主维管束的微氧胁迫中发挥重要作用,同时该基因簇通过参与次级化合物NAE12:0的代谢,干扰棉花体内FAAHs基因的表达,导致寄主对ABA敏感性增强和体内激素水平失衡,最终引起寄主落叶表型。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.44
【图文】：

侵染循环,病害,致病机理研究

图 1.1 棉花黄萎病病害侵染循环Fig. 1.1 Development and disease cycle of Verticillium dahliae菌致病机理研究进展丽轮枝菌引起的黄萎病研究主要集中在两个方面：一是围绕绕寄主的防控技术研究（Kelly et al., 2009; EI-Bebany et al., 2al., 2012）。其中，针对大丽轮枝菌为害/致病机制已经开展了流行学、基因组学与蛋白组学、致病基因与作用机理、病原相关基因的鉴定及其致病机理研究已经成为当前研究的热点（2009）；菌致病相关基因的鉴定及其致病机理的研究，现阶段主要集壁水解酶类，包括果胶裂解酶、纤维素降解酶和糖基转移酶白激酶，通过调控下游细胞壁降解酶的活性，进而参与植物影响大丽轮枝菌对寄主的致病性；（2）分泌蛋白类，主要包（Gao et al., 2010; Michielse et al., 2011; Liu et al., 2013），Vd蛋白，与寄主体内的靶蛋白互作，诱导寄主的免疫防卫反应抗病基因 Ve1，进而调控寄主的免疫反应(Fradin et al., 2009

谱系,大丽轮枝菌,病原菌,落叶

60℃ 30 sec72℃ 1 min72℃ 10 min12℃ ∞ 实验结果1 不同寄主来源的落叶和非落叶大丽轮枝菌性状分析利用落叶型（D）和非落叶型（ND）遗传标记对三株不同寄主来源的大丽轮枝菌（Vs.17 和 JR2）进行 PCR 验证，实验结果表明 Vd991 含有落叶型标记而缺失非落叶型标s.17 和 JR2 含有非落叶型标记缺失落叶型标记（图 2.1A）。进一步对三株不同寄主来枝菌进行落叶表型鉴定，结果发现高感大丽轮枝菌的军棉 1 号在接菌 Vd991 大约 4 周叶型表现，而 VdLs.17 和 JR2 呈现出非落叶型表型（图 2.1B），同时 VdLs.17 和 JR2 殖量与 Vd991 相比相差近百倍（图 2.1C 和 D），确证大丽轮枝菌的落叶型与 Vd991 束中高繁殖量的优势适应性一致，而 VdLs.17 和 JR2 相对 Vd991 缺失谱系特异片段 G-说明可能参与大丽轮枝菌引起寄主的落叶表型。36 cycles

大丽轮枝菌,共线性,特异基因,谱系

业科学院硕士学位论文第二章大丽轮枝菌落叶性状遗传变主适应性中发挥着重要作用（Klosterman et al., 2011; de Jonge et al., 2013）。通过对大丽轮枝菌 Vd991 与大丽轮枝菌 JR2（来源于番茄）和 VdLs.17（来源于莴苣）的较和共线性分析发现每个基因组均存在多个基因组特异区段，基因组特异区段由许因组成（图 2.2），与番茄大丽轮枝菌 JR2 和莴苣大丽轮枝菌 VdLs.17 基因组比较结losterman et al., 2011; de Jonge et al., 2013）；其中，棉花大丽轮枝菌 Vd991 存在四个特异区段（G-LSR1~G-LSR4），4 个片段各自编码了 32、23、101 和 60 基因。基因特异区段编码的致病相关基因其可能主要参与大丽轮枝菌的毒力和寄主生态位的适G-LSR2 主要编码了 23 基因，其中有 6 个属于分泌蛋白类、糖苷水解酶类、转录因。

【参考文献】