光皮桦KNOX基因的克隆及其功能研究

发布时间：2020-08-11 18:16

【摘要】：光皮桦为我国优良速生用材树种,其分布范围广,生长迅速,材质优良,被国家列为一级材,同时也是林木遗传育种的的优良材料。近年来,木材材性性状成为林木研究的热点之一。本论文利用生物信息学工具以及基因克隆、定量PCR等分子生物学技术挖掘光皮桦材性相关KNOX基因,分析其功能,以期为光皮桦分子辅助育种提供重要依据。主要结果如下:在转录组测序的基础上,利用RACE技术从光皮桦中分离得到10个BlKNOX基因,序列全长范围在4332-9208bp之间,ORF长度在408-1220bp之间,预测编码的10个蛋白序列由136-376个氨基酸残基组成,氨基酸序列之间一致性在12.7-64.8%之间。生物信息学分析发现它们具有典型的KNOX结构域,除BlKNOX6外,其他基因均具有完整的KNOX结构域。系统进化分析发现,KONX蛋白主要分为两大类:KNOXⅠ类和KNOXⅡ类。KNOXⅠ类包括:BlSTM、BlKNOX1、BlKNOX2、BlKNOX3、BlKNOX4和BlKNOX9。KNOXⅡ类包括:BlKNOX5、BlKNOX7和BlKNOX8,其中具有不完整KNOX结构域的BlKNOX6属于miniKNOX类。从基因结构看,10个光皮桦BlKNOX基因结构差异明显,说明它们在光皮桦生长发育过程中发挥的功能可能存在差异。BlKNOX基因上游调控序列搜寻结果显示,10个BlKNOX基因启动子区所含顺式作用元件个数和类别不同,进一步表明他们在光皮桦个体发育过程中可能扮演着不同的角色,调控不同的代谢途径。定量PCR结果显示10个BlKNOX基因在光皮桦的不同组织器官中特异性表达。BlKNOX1在成熟的雄花中表达量最高,其次是在茎和雌花中,而且在不同木质化程度的茎段中,BlKNOX1表达量均有较高表达。BlKNOX2在所有茎和花中均有较高的表达量,并且随茎段木质化程度的升高而升高,在嫩叶中表达量最低。BlKNOX3在茎中的表达量明显高于其它器官,且随木质化程度的增高而增高。BlKNOX4、BlSTM具有类似的表达模式,在茎和幼嫩雄花中具有较高的表达量,在叶中几乎不表达。BlKNOX5、BlKNOX 7也具有类似的表达模式,分别在成熟叶和嫩叶中表达量最高。BlKNOX6和BlKNOX9都在雌花和叶中的表达量较高。BlKNOX8基本只在雌花中表达,尤其是在幼嫩雌花中表达量最高。激素处理实验表明IAA对BlKNOX2和BlSTM表达的诱导效应较明显,并且随着茎段木质化程度增高诱导效应越明显。6-BA只对BlKNOX4基因的表达有明显抑制作用。GA、ACC胁迫处理后,5个BlKNOX基因的表达情况相似,除BlSTM基因的表达量提高,其余基因的表达均受到不同程度的抑制。NAA处理对5个BlKNOX基因的诱导情况与GA、ACC刚好相反。不同激素处理对BlKNOX基因的诱导效应不同,暗示BlKNOX基因参与的调控途径可能并不完全相同。人工拉弯处理后5个BlKNOX基因的表达有所差别:BlKNOX1和BlSTM的表达量在TW和OW中均下降,且在TW中下降更明显;BlKNOX2、BlKNOX7和BlKNOX4在TW中的表达量均升高,在OW中的表达量与对照相差无几。将光皮桦BlKNOX1、BlKNOX3超表达载体分别转化烟草和光皮桦,均获得阳性植株。观察烟草转基因阳性植株发现,与野生型相比,转基因株系茎干更挺立,叶片边缘产生皱折且叶脉更深。GUS染色也发现,烟草阳性植株茎段能染成蓝色。Maule染色法切片观察发现,转基因烟草的木质化程度高于对照。光皮桦转化植株目前只检测出阳性植株,表型观察及染色分析还需进一步探究。以上实验结果不仅为深入解析光皮桦木材形成的分子机制奠定了基础,而且为后续光皮桦分子辅助育种提供了基因资源。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S792.15
【图文】：

示意图,蛋白结构,示意图

之间含有 3 个氨基酸（P-Y-P）[6,7]。KNOX 蛋白包含 4 个结构域，依次为 KNOX1、KNOX2、ELK 和Homeobox KN[8]。KNOX1区域位于蛋白质的 N端，下游为 KNOX2区域，KNOX1 和 KNOX2 亚域共同组成 MEINOX 区域。MEINOX 区域是由α螺旋组成的二级结构，其中一些螺旋具有双亲和性，主要保守位点在疏水残基。MEINOX 区域下游是不保守的 GSE 序列，可作为蛋白降解信号。紧邻的是一个高度保守的 ELK 基序，可抑制靶基因的表达，涉及蛋白质间的相互作用[2]。KN 位于蛋白质的 C 端，参与 DNA 的结合和同源二聚体的形成。根据同源结构域中氨基酸序列表达模式及内含子的位置不同，KNOX 基因可分为两类亚家族：Ⅰ类和Ⅱ类[9,10]。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中含 I 类和 II 类 KNOX 基因各 4 个：KN1-like in Arabidopsis thaliana1（KNAT1）、KNAT2、KNAT6 和 ShootMeristemless（STM）为 I 类； KNAT3、KNAT4、KNAT5 和 KNAT7 为 II 类。大豆（Glycine max）中 KNOX 基因有 27 个：GmKNOX1-10，GmKNOX14，GmKNOX27为 I 类；GmKNOX11-13，GmKNOX15-26，为 II 类。番茄（Solanum lycopersicum）中含 4 个 KNOX I 类基因：Tkn1、Tkn2 /Le T6、Tkn4 和 Tkn3；通过比对 II 类有3 个：Tkn1L3、T12 和 THox2。

技术路线图,技术路线

技术路线

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20图 2.1 光皮桦 KNOX 基因氨基酸序列比对Fig 2.1 Secquence alignment of amino acid sequences of BlKNOXs genes

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