长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因克

发布时间：2017-03-31 06:47

  本文关键词：长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因克隆、原核表达及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)是专性吸血的体外寄生虫,在自然界中存在两性生殖种群与孤雌生殖种群,可携带多种病原体而导致疾病,给人类健康和畜牧业生产带来极大危害。防御素(defensin)是一种抗微生物肽,在动植物中广泛存在,尤其在节肢动物中,由于缺乏适应性免疫反应,防御素在其先天免疫防御过程中发挥重要作用,可以有效对抗入侵的病原体。蜱作为专性吸血的特殊类群,同样具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原体的侵袭。本研究以长角血蜱孤雌生殖种群为研究对象,利用Clontech建库试剂盒和3’RACE的方法构建cDNA文库,分子克隆得到三条防御素基因,分别命名为Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。开放阅读框大小分别为225bp、210bp和237bp,编码氨基酸个数为74、69和78,成熟肽长度分别为38、37和46,等电点分别为9.69、8.33和9.50。通过对Hp-defensin-1进行原核表达及功能分析,结果表明,长角血蜱Hp-defensin-1与边缘革蜱(ACJ04433.1)同源性最高,为75.68%。系统发育树表明,Hp-defensin-1基因序列与革蜱属(森林革蜱KJ885301.1)亲缘关系最近。荧光定量结果表明,Hp-defensin-1表达量在不同时期和不同组织存在显著性差异(P0.05),大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌胁迫效果依次减弱。将Hp-defensin-1连入载体pET-32(a+),并转入BL21中表达,表达产物经SDS-PAGE电泳显示目的蛋白大小约23kDa,与预测大小一致。该多肽对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌性,对部分革兰氏阴性菌和真菌也具有一定的抗菌活性。表达产物的抗氧化实验表明,该多肽对ABTS·+和DPPH·自由基具有很强的清除能力,具有很强的抗氧化活性,但不存在溶血活性,因此对健康的人血细胞无伤害,为新型抗菌药物的研发提供了基础。
【关键词】：长角血蜱 孤雌生殖种群 防御素 原核表达 功能分析
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q969.91
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-15
• 1.1 引言10
• 1.2 孤雌生殖种群简介10-11
• 1.3 抗菌肽简介11-12
• 1.4 昆虫抗菌肽简介12-13
• 1.5 展望13-15
• 第二章 长角血蜱孤雌种群防御素基因的分子克隆15-30
• 2.1 实验材料15
• 2.1.1 实验动物15
• 2.1.2 实验试剂及耗材15
• 2.1.3 实验仪器15
• 2.2 实验方法15-21
• 2.2.1 长角血蜱孤雌生殖种群总RNA的提取15-16
• 2.2.2 cDNA文库的构建16-18
• 2.2.2.1 建库试剂盒构建16-17
• 2.2.2.2 3’RACE反转获得cDNA17-18
• 2.2.3 抗菌肽基因的克隆18-21
• 2.2.4 抗菌肽基因的全长的扩增21
• 2.3 实验结果21-28
• 2.3.1 长角血蜱孤雌生殖种群总RNA的提取21-22
• 2.3.2 cDNA文库的构建22
• 2.3.3 抗菌肽基因的克隆22-24
• 2.3.4 抗菌肽基因的生物信息学分析24-28
• 2.3.4.1 基因序列分析24-26
• 2.3.4.2 Hp-defensin13 的系统发育树分析26
• 2.3.4.3 蛋白序列分析26-28
• 2.4 讨论28-30
• 2.4.1 抗菌肽基因的克隆28
• 2.4.2 抗菌肽的生物学分析28-30
• 第三章 长角血蜱孤雌种群防御素基因的原核表达30-46
• 3.1 实验材料30
• 3.1.1 实验试剂及耗材30
• 3.1.2 实验仪器30
• 3.2 实验方法30-38
• 3.2.1 构建Defensin基因的原核表达载体30-33
• 3.2.2 重组质粒pET-32(a＋)- defensin的诱导表达33-36
• 3.2.3 重组蛋白的质谱鉴定36-37
• 3.2.4 重组蛋白诱导表达的条件优化37
• 3.2.5 重组蛋白的纯化37-38
• 3.2.5.1 重组蛋白的大量收集37
• 3.2.5.2 装柱准备37-38
• 3.2.5.3 蛋白上清的亲和层析38
• 3.3 实验结果38-44
• 3.3.1 构建Defensin基因的原核表达载体38-40
• 3.3.2 重组质粒pET-32(a＋)- defensin的诱导表达40-41
• 3.3.3 重组蛋白诱导表达的条件优化41-44
• 3.3.4 重组蛋白的纯化44
• 3.4 讨论44-46
• 3.4.1 原核表达载体的选择与构建44-45
• 3.4.2 蛋白诱导表达条件的优化与纯化45-46
• 第四章 长角血蜱孤雌种群防御素的功能分析46-61
• 4.1 实验材料46
• 4.1.1 实验试剂及耗材46
• 4.1.2 实验仪器46
• 4.2 实验方法46-51
• 4.2.1 长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因表达量的分析46-48
• 4.2.1.1 防御素基因在不同时期不同组织中的表达量46-47
• 4.2.1.2 防御素基因不同菌胁迫下的表达量47-48
• 4.2.2 抑菌活性的分析48-50
• 4.2.3 抗氧化的分析50-51
• 4.2.4 溶血活性的分析51
• 4.3 实验结果51-59
• 4.3.1 长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因表达量的分析51-54
• 4.3.2 抑菌活性的分析54-57
• 4.3.3 抗氧化的分析57-58
• 4.3.4 溶血活性的分析58-59
• 4.4 讨论59-61
• 4.4.1 防御素基因的定量分析59-60
• 4.4.2 HP-defensin-1 重组蛋白的功能分析60-61
• 参考文献61-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间取得的科研成果清单67

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