Gαq基因表达调控机制的研究

发布时间：2020-08-13 12:29

【摘要】：自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)是一种有较高发病率的病种,发病机制尚不明确[1]。G蛋白是三聚体蛋白质,包含α、β和γ这三个亚单位。根据α亚单位的不同可将G蛋白分为Gs、Gi/o、Gq/11和G12/13四个亚家族。Gαq是G蛋白家族中Gq/11亚家族成员之一,是跨膜信号传导通路的重要组成部分。Gαq是由GNAQ基因编码的蛋白功能单位[2],其基因缺陷小鼠表现出某些AID症状,而且在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等AID患者,其外周血单个核细胞中Gαq mRNA和蛋白表达水平较健康个体明显降低,且与疾病活动度、相关的细胞因子和自身抗体的产生呈负相关[3,4]。这表明,Gαq的表达降低可能参与了 AID的发病。但调控Gαq表达降低的机制尚不清楚。真核生物基因表达调控中组蛋白乙酰化修饰占据着十分重要的地位,组蛋白乙酰化通过控制染色质的结构来调控基因表达。本课题以组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素(TSA)作为诱导乙酰化的因素,探索乙酰化对293T细胞中Gαq mRNA和蛋白表达水平的影响,还将筛选鉴定调控GNAQ基因表达的转录因子,进一步研究Gαq表达降低的机制。首先我们通过实时荧光定量PCR和Western blot方法检测到在293T细胞中,TSA以浓度依赖方式上调Gαq表达。流式细胞术检测了不同浓度TSA对293T细胞凋亡的影响,还用Western blot方法验证了 TSA处理293T细胞后组蛋白H3和H4的乙酰化水平增加,表明Gαq表达增加与组蛋白的乙酰化有关。我们还通过软件分析发现GNAQ启动子区内有SP1,EGR-1,MZF1,GATA-1等转录因子的结合位点。运用实时荧光定量RCR和western blot方法筛选出转录因子GATA-1在TSA处理下呈浓度依赖增高,与Gαq的表达一致。免疫沉淀实验进一步验证了TSA处理下GATA-1蛋白表达增高。运用CHIP及EMSA实验分别在体内和体外条件下证实了GNAQ启动子区(-569～-559)为GATA-1结合位点,并且TSA可增强转录因子GATA-1与该位点结合从而上调GNAQ转录表达。综上所述,Gαq表达受到组蛋白乙酰化和转录因子GATA-1的调控。本研究可为AID的治疗提供一种新思路。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.2
【图文】：

常规,细胞,浓度

逦＃逡逑ＴＳＡｎＭ逡逑图３．２邋ＴＳＡ５０－２００ｎＭ处理２９３Ｔ细胞２４小时后Ｇａｑ邋ｍＲＮＡ水平明显升高，并有逡逑浓度依赖的特征。逡逑Ｆｉｇ．３．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｇａｑ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ逡逑ｂｙ邋ＴＳＡ５０－２００ｎＭ邋ｉｎ邋ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｍａｎｎｅｒｓ．邋Ｔｈｅ邋ｉｎｓｅｔｓ邋ｓｈｏｗ邋ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｌ＇Ｇｃｘｑ逡逑２９逡逑

细胞,去乙酰化

逑ｇａｐｄｈ邋＃椋椋椋椋rxlSI逡逑图３．１常规ＰＣＲ检测Ｇｃｔｑ在２９３Ｔ细胞中表达。逡逑Ｆｉｇ３．１邋ｌｉｔ邋ｈａｓ邋ｂｅｅｎ邋ｓｈｏｗｎ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｇａｑ邋ｉｎ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ逡逑ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ａｎａｌｙｓｉｓ．逡逑３．２逦ＴＳＡ对２９３Ｔ细胞Ｇａｑ邋ｍＲＮＡ水平的影响逡逑ＴＳＡ是ＨＤＡＣｓ家族的广泛的抑制剂，能抑制ＨＤＡＣｓ的去乙酰化活性。荧光逡逑定量ＰＣＲ结果显示，２９３Ｔ细胞经５０ｎＭ、１００ｎＭ及２００ｎＭＴＳＡ作用２４ｈ，邋ＧａｑｍＲＮＡ逡逑水平呈上升趋势，并呈现出明显的浓度依赖的变化特征（Ｆｉｇ．３．２．）。逡逑工逡逑0邋★逡逑＾逦１－５－１邋Ｉ逦１逡逑Ｈｉｉｉｌ逡逑Ｉ逦？逦＃逡逑ＴＳＡｎＭ逡逑图３．２邋ＴＳＡ５０－２００ｎＭ处理２９３Ｔ细胞２４小时后Ｇａｑ邋ｍＲＮＡ水平明显升高，并有逡逑浓度依赖的特征。逡逑Ｆｉｇ．３．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｇａｑ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋２９３Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ逡逑ｂｙ邋ＴＳＡ５０－２００ｎＭ邋ｉｎ邋ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｍａｎｎｅｒｓ．邋Ｔｈｅ邋ｉｎｓｅｔｓ邋ｓｈｏｗ邋ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｌ＇Ｇｃｘｑ逡逑２９逡逑

细胞,去乙酰化,浓度,变化特征

【参考文献】