新疆甜瓜eIF4E和MLO基因的敲除及功能分析
发布时间：2020-08-14 07:10
【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是新疆重要的经济作物,新疆主栽甜瓜品种“皇后”因具有优良的农艺性状,而广受消费者喜爱,但其易感病,使品质下降,严重时导致大面积减产。因此,提高抗病能力是甜瓜生产中急需解决的一个难题。CRISPR/Cas9是一种后天免疫系统,存在于所有的古生菌和大多数细菌中,已在动植物的基因工程和遗传育种中得到了广泛的应用。由于CRISPR/Cas9基因组编辑技术具有高效、便捷、成本低廉等优点而备受关注。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定点敲除新疆主栽甜瓜品种“皇后”的病毒病感病基因eIF4E和白粉病感病基因MLO,以期获得广谱抗病的甜瓜品种。主要结果如下:1.对分别接种病毒病和白粉病病菌的甜瓜叶片进行RT-PCR半定量,未接种的植株作为阴性对照,结果表明,接种病毒病和白粉病植株的eIF4E和MLO基因表达量高于对照,初步推测在侵染初期,病毒病和白粉病的病菌需要eIF4E和MLO基因的协助来完成在甜瓜中的生长繁殖。2.甜瓜eIF4E基因全长为2807 bp,总共含有5个外显子和4个内含子,靶序列中靶率为0.5906;甜瓜MLO基因全长为4500 bp,总共含有15个外显子和14个内含子,靶序列中靶率为0.7729。3.以双子叶植物敲除载体pP1C.4为模板进行sgRNA框的扩增,成功构建了重组载体pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO。4.探索不同浓度组合的IAA和6-BA对“皇后”外植体的影响,结果表明,当在MS固体培养基中添加的6-BA浓度为1 mg·L~(-1),IAA的浓度为0.05 mg·L~(-1)时,愈伤组织的生长状态良好,因而该浓度的激素组合对不定芽具有较高的诱导率。5.本实验确定了“皇后”对培养基中潮霉素的选择压以及头孢的最适抑菌浓度。当添加浓度为10mg·L~(-1)的潮霉素时,抑制了外植体的生长,可选择10mg·L~(-1)作为抗生素的临界浓度;当头孢的浓度为500 mg·L~(-1)时,对农杆菌的抑制效果最好,并且不会对外植体的生长造成太大影响,可将500mg·L~(-1)作为头孢的最适抑菌浓度。6.通过冻融法成功将重组载体pP1C.4-eIF4E和pP1C.4-MLO转入农杆菌GV3101中,经过为期一年多的遗传转化,经潮霉素筛选获得了11株转化植株,通过检测抗潮霉素基因初步得到9株阳性转化苗,对转化苗的靶序列进行测序比对,结果表明,在靶位点附近没有发生基因突变。本文为甜瓜的抗病研究提供了新的思路,为进一步研究甜瓜eIF4E和MLO基因的功能奠定了基础。
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S652
【图文】：
图 1-1 植物总 RNA 的提取 Marker:2000bpFig 1-1 Extraction of Plant Total RNAMarker: 2000b 基因表达差异分析为模板，合成 cDNA 的第一链，然后进行 如下图，泳道 1 为接种叶的目的基因扩增条条带，第二行是甜瓜 Actin 的扩增结果，条。图 1-2 为 eIF4E 基因扩增结果，第 1 和第毒的侵染，eIF4E 均有表达，且第 2 泳道条 基因的表达量上升；图 1-3 为 MLO 基因扩侵染，MLO 基因均有表达，且第 2 泳道条LO 基因的表达量上升。
图 1-2 eIF4E 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig.1-2 Differences in expression of eIF4E gene in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control图 1-3 MLO 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig. 1-3 Difference of MLOgene expression in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control讨论2006 年 Nieto C.[87]在甜瓜中定位了 eIF4E 基因，并提出 eIF4E 基因是甜瓜马铃薯 Y 病毒属病毒的致病因子。随后在国外也陆续出现了大量有关于4E 基因的研究，国内研究比较多的植物有番茄、烟草、番木瓜等等，而对于的 eIF4E 基因未见报道。2009 年陈鸿[58]从甜瓜中克隆了 MLO 家族的三个基因，分别为 Cm MLO1、 MLO2 和 Cm MLO3，其中 Cm MLO2 和拟南芥的 At MLO2、At MLO6 和LO12 具有较近的进化关系。在白粉病菌侵染后，Cm MLO2 在叶片中的表达高。在本文主要研究的就是 Cm MLO2 基因。2014 年徐坚[65]对甜瓜 MLO 基
图 1-2 eIF4E 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig.1-2 Differences in expression of eIF4E gene in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control图 1-3 MLO 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig. 1-3 Difference of MLOgene expression in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control讨论2006 年 Nieto C.[87]在甜瓜中定位了 eIF4E 基因，并提出 eIF4E 基因是甜瓜马铃薯 Y 病毒属病毒的致病因子。随后在国外也陆续出现了大量有关于4E 基因的研究，国内研究比较多的植物有番茄、烟草、番木瓜等等，而对于的 eIF4E 基因未见报道。2009 年陈鸿[58]从甜瓜中克隆了 MLO 家族的三个基因，分别为 Cm MLO1、 MLO2 和 Cm MLO3，其中 Cm MLO2 和拟南芥的 At MLO2、At MLO6 和LO12 具有较近的进化关系。在白粉病菌侵染后，Cm MLO2 在叶片中的表达高。在本文主要研究的就是 Cm MLO2 基因。2014 年徐坚[65]对甜瓜 MLO 基
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S652
【图文】：
图 1-1 植物总 RNA 的提取 Marker:2000bpFig 1-1 Extraction of Plant Total RNAMarker: 2000b 基因表达差异分析为模板，合成 cDNA 的第一链，然后进行 如下图，泳道 1 为接种叶的目的基因扩增条条带，第二行是甜瓜 Actin 的扩增结果，条。图 1-2 为 eIF4E 基因扩增结果，第 1 和第毒的侵染，eIF4E 均有表达，且第 2 泳道条 基因的表达量上升；图 1-3 为 MLO 基因扩侵染，MLO 基因均有表达，且第 2 泳道条LO 基因的表达量上升。
图 1-2 eIF4E 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig.1-2 Differences in expression of eIF4E gene in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control图 1-3 MLO 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig. 1-3 Difference of MLOgene expression in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control讨论2006 年 Nieto C.[87]在甜瓜中定位了 eIF4E 基因，并提出 eIF4E 基因是甜瓜马铃薯 Y 病毒属病毒的致病因子。随后在国外也陆续出现了大量有关于4E 基因的研究，国内研究比较多的植物有番茄、烟草、番木瓜等等，而对于的 eIF4E 基因未见报道。2009 年陈鸿[58]从甜瓜中克隆了 MLO 家族的三个基因，分别为 Cm MLO1、 MLO2 和 Cm MLO3，其中 Cm MLO2 和拟南芥的 At MLO2、At MLO6 和LO12 具有较近的进化关系。在白粉病菌侵染后，Cm MLO2 在叶片中的表达高。在本文主要研究的就是 Cm MLO2 基因。2014 年徐坚[65]对甜瓜 MLO 基
图 1-2 eIF4E 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig.1-2 Differences in expression of eIF4E gene in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control图 1-3 MLO 基因在叶片中的表达差异1：接种叶；2：阴性对照Fig. 1-3 Difference of MLOgene expression in leaves1: inoculated leaf; 2: negative control讨论2006 年 Nieto C.[87]在甜瓜中定位了 eIF4E 基因，并提出 eIF4E 基因是甜瓜马铃薯 Y 病毒属病毒的致病因子。随后在国外也陆续出现了大量有关于4E 基因的研究，国内研究比较多的植物有番茄、烟草、番木瓜等等，而对于的 eIF4E 基因未见报道。2009 年陈鸿[58]从甜瓜中克隆了 MLO 家族的三个基因，分别为 Cm MLO1、 MLO2 和 Cm MLO3，其中 Cm MLO2 和拟南芥的 At MLO2、At MLO6 和LO12 具有较近的进化关系。在白粉病菌侵染后，Cm MLO2 在叶片中的表达高。在本文主要研究的就是 Cm MLO2 基因。2014 年徐坚[65]对甜瓜 MLO 基
【参考文献】
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本文编号：2792691
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