地衣芽孢杆菌多糖合成关键基因研究及絮凝剂高产重组菌株构建
发布时间：2020-08-14 13:44
【摘要】：多糖和Y-聚谷氨酸(γ-PGA)作为两种常见的絮凝活性物质,因其具有生物可降解、无毒、高效以及无二次污染等优点,在废水处理、食品与发酵工业、饮用水净化等领域受到越来越多的关注。以实验室自主筛选获得的菌株Bacillus licheniformis CGMCC2876为出发菌株,在不同的培养条件下可以同时分泌多糖和γ-PGA两种具有絮凝活性的胞外聚合物。本论文选取以葡萄糖为碳源的培养体系为主要研究对象,旨在探究地衣芽孢杆菌多糖合成代谢途径中的若干关键基因,进而通过基因工程手段构建生物絮凝剂高产重组菌株,以挖掘地衣芽孢杆菌多糖絮凝剂的工业生产潜力。首先选取地衣芽孢杆菌多糖合成代谢途径中的一系列基因pgcA、crr、gtaB1、epsA以及epsB,通过PCR技术进行扩增,与实验室之前构建的表达载体pHY300PLK-PamyL-TTamyL进行连接得到基因过表达重组载体,随后通过电转化的方法导入地衣芽孢杆菌中表达,成功构建了六株目的基因过表达重组菌株。对重组菌株所产絮凝剂的产量和活性进行测定,并与原始菌株进行对比,其中重组菌株B.licheniformis-pHY300-epsA和B.licheniformis-pHY300-pgcA-gtaB1所产絮凝剂的粗产量与原始菌株相比有明显提高,分别提高了 23.70%和20.77%。但单独过表达葡萄糖磷酸变位酶基因pgcA和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因gtaB1对于地衣芽孢杆菌生产多糖絮凝剂没有明显影响,说明增强糖基转移酶基因epsA和串联基因pgcA-gtaB1的表达水平可以促进多糖絮凝剂的合成,而单独调控基因pgcA和gtaB1的表达对于多糖合成水平的影响很小。重组菌株B.licheniformis-pHY300-epsB不仅可以使絮凝剂的粗产量提高13.98%,达到8.56 g·L-1,还可以使絮凝活性达到5100.50 U·mL-1,较原始菌株提高 117.92%。B.licheniformis-pHY300-epsB所产的絮凝活性物质中多糖含量从53.67%降低至28.95%,而γ-PGA含量从34.13%升高到44.03%。同时多糖和y-PGA代谢途径中一系列关键基因的转录水平也发生了变化。碳代谢调控蛋白基因ccpA和ccpN的转录水平有所下降,而氮代谢调控蛋白基因nrgB、γ-PGA合成酶基因pgsA和pgsB、异柠檬酸脱氢酶基因icd以及1-吡咯啉-5-羧酸盐脱氢酶基因rocA的转录水平则发生了不同程度的提高。因此,epsB在多糖和γ-PGA的合成过程中均发挥了重要的作用,对epsB进行调控可以改变菌体内的碳代谢流方向,从而影响地衣芽孢杆菌多糖和γ-PGA的合成水平。以2 L发酵罐对B.licheniformis-pHY300-epsB进行扩大培养,所产絮凝剂活性较原始菌株提高了 224%,粗产量提高了 36.62%,表现出一定的工业生产能力。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;Q93
【图文】：
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本文编号：2793108
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;Q93
【图文】：
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