哈茨木霉铜胁迫应答相关转录因子基因thmea1功能研究

发布时间：2020-08-18 08:40

【摘要】：木霉菌(Trichoderma)作为生物活体制剂农药和肥料的有效成分,在植物病害生物防治、土壤环境改良方面有巨大的应用潜力。近年来由于铜及含铜化合物被广泛应用于杀菌剂、化学杀虫剂及畜牧食品添加剂等,致使土壤铜含量不断增加,对土壤微生物造成不良影响,引起土壤生态系统失衡和土壤质量下降。研究木霉菌铜耐受及代谢相关机制,对提高防病效果、改善土壤生态环境等具有重要意义。本实验室前期研究发现,生防菌哈茨木霉(T.harzianum)Th33中存在一种C2H2型转录因子,命名为thmea1,该基因在铜胁迫下发生差异表达,其编码的蛋白序列中存在3个与酵母金属硫蛋白表达激活因子ACE2保守的C2H2结构域,推测该基因可能参与哈茨木霉菌的铜胁迫应答及代谢过程。为进一步研究其功能,本研究采用基因敲除和过表达技术,结合荧光定量PCR技术和转录组测序分析,探究了thmea1基因的功能,结果如下:1、参照哈茨木霉Th33基因组信息,设计特异性引物,以Th33菌株cDNA为模板,PCR扩增获得thmea1基因编码区序列。测序结果显示,该基因全长1446 bp,无内含子,拥有1个外显子,编码蛋白序列与酵母金属硫蛋白表达激活因子ACE2及其同源蛋白SWI5存在3个较为保守的C2H2锌指结构域,推测thmea1为C2H2型转录因子基因,序列提交NCBI获得GenBank登录号为MF802279。2、采用同源敲除原理构建获得thmea1基因敲除载体pKH-KO-△thmea1,采用PEG介导的原生质体转化法,将敲除载体转入哈茨木霉Th33原生质体,筛选获得thmea1基因敲除突变株△thmea1。以构巢曲霉gpdA和trpC为启动子和终止子构建获得thmea1基因过表达载体pKH-KO-Othmea1,采用PEG介导的原生质体转化法,将过表达载体转入Th33原生质体,筛选获得thmea1基因过表达突变株Othmea1。3、对野生菌Th33、敲除突变株△thmea1和过表达突变株Othmea1的铜离子耐受实验显示,在0~2.4 mM/L铜离子浓度下,Δthmea1的生长速度显著快于Th33和Othmea1,气生菌丝量略多,且铜离子耐受中浓度(MIC_(50))为1.92 mM/L,较Th33(MIC_(50)0 1.70 mM/L)和Othmea1(MIC_(50)0 1.74mM/L)提高了约12.9%。铜离子吸附实验显示,野生菌和突变株对铜离子的吸附率无显著差异。综上表明thmea1基因的缺失提高了哈茨木霉对铜离子的耐受性。4、铜代谢相关基因的qRT-PCR分析显示,铜胁迫下,△thmea1中的金属硫蛋白基因(Tha_07074)表达水平显著高于Th33和Othmea1,表达量约为Th33的5倍,推测thmea1基因负调控金属硫蛋白基因的表达。P型-ATP酶基因(Tha_08191)在Th33和Othmea1中的表达水平显著高于△thmea1,该转运酶能够协助细胞内铜离子进入高尔基体分泌系统,暗示thmea1的缺失可能会影响铜离子的胞外释放过程。5、对野生菌Th33和敲除突变株Δthmea1进行了0.8 mM/L铜离子处理下的转录组测序,显示在铜胁迫下,核糖体蛋白合成相关基因、逆境修复功能类热激蛋白相关基因及泛素蛋白相关基因在Δthmea1中发生上调表达,推测thmea1可能具有调控功能性蛋白质再生循环的作用,其调控机制有待进一步研究。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476
【图文】：

标准曲线,标准曲线,准曲线,哈茨木霉

中国农业科学院硕士学位论文第二章哈茨木霉 thmea1 的克隆与分析（101）100%(1/) KE ，得到 thmea1 扩增效率 62.9%，thga1 扩增效率为 63.6%，以上结果表明两质粒标准品建立的标准曲线良好，且两基因扩增效率一致，实验结果较为可靠。图 2.3 thmea1 与 thga1 扩增产物溶解曲线Fig 2.3 Dissolution curve of amplified products of thmea1 and thga11 2A B

序列,结构分类,哈茨木霉

图 2.6 thmea1 编码蛋白结构分类预测Fig. 2.6 Structure classification prediction of thmea1 coding protein2.4 讨论本章从哈茨木霉 Th33 中克隆获得了 thmea1，并对其进行了基因组拷贝数验证、序列分析、同源蛋白检索及蛋白质功能预测等。对基因拷贝数的验证采用了双标准曲线绝对定量法，该方法在现代转基因工程中，被广泛应用于外源基因插入拷贝数的验证，具有准确快速的特点，该方法的关键是保证被检测基因与内源单拷贝参考基因具有相对一致的扩增效率，从而确保绝对定量的准确性，本实验中 thmea1 与 thga1 的扩增效率分别为 62.9%和 63.6%，具有较好的一致性，故结果可靠。对 thmea1 编码蛋白序列检索显示，该基因在其他木霉中的同源蛋白功能均未验证，为未知蛋白，与刚毛绿僵菌（M.acridum）C2H2 转录因子 SWI5 和厚垣普可尼亚菌（P. chlamydosporia）金属硫蛋白表达激活因子 VFPPC 具有一定的相似性，通过 STRING 功能蛋白数据库的进一步检索，显示与酵母的两个 C2H2 型转录因子 SWI5 和 ACE2 具有较为保守的 3 个 C2H2 型锌指结构域，其中 ACE2 为酵母金属硫蛋白 CUP1 表达调控因子，此外，通过 CATH 蛋白结构分类数据库的比对显示 thmea1 为锌指蛋白类调控因子基因，综上推测 thmea1 可能为哈茨木霉金属硫蛋白表达调控因子，且参与哈茨木霉铜胁迫下的调控作用，其功能需要后续研究。

序列,载体,序列,构建原理

2F AGTGACAAACGGTGAAGTTG下游同源臂扩增2R GCATCCAATGTTATGGGCmeaF ATGCCTCACCCAATGACAAAthmea1 序列扩增meaR GGCTACACCGTTGAACTCGThygF ATGAAAAAGCCTGAACTCACC潮霉素抗性基因扩增hygR TTTCCACTATCGGCGAGTtzF ATATACTGCTCAGCCGCCthmea1 基因探针扩增tzR AAACTTGTTGCCGCAGTCG3.2 方法3.2.1 thmea1 敲除载体 pKH-KO-△thmea1 的构建采用同源敲除原理，将 thmea1 起始密码子上游 1000 bp 序列插入到 pKH-KO 质粒潮霉素抗性基因（hyg）启动子上游限制性酶切位点 BamHⅠ和 EcoRⅠ之间，将 thmea1 基因终止密码子下游 1000 bp 序列插入到 hyg 下游限制性酶切位点 HindⅢ和 XhoⅠ之间，构建获得具有 thmea1 基因同源打靶臂的基因敲除载体 pKH-KO-△thmea1，构建原理见图 3.1 所示。

【参考文献】