霍乱弧菌zot基因的克隆表达及其对人小肠上皮细胞凋亡作用的研究

发布时间：2020-08-18 14:10

【摘要】：目的:用PCR方法检测霍乱弧菌ctxAB和zot毒力基因,研究两毒力基因之间的共存关系,从霍乱弧菌(Vibriocholera)M045中克隆小带联结毒素(zonulaoccludenstoxin,zot)的全基因序列,构建其原核表达质粒pET-32a(+)-zot并转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中,通过诱导表达和亲和层析纯化重组蛋白,初步研究zot表达蛋白对人小肠上皮细胞的凋亡作用。方法:1、用PCR检测方法检测江西省2000~2012年分离的239株霍乱弧菌中ctxAB和zot毒力基因。2、采用PCR技术从霍乱弧菌M045中抽提基因组DNA中扩增出zot基因。3、将zot基因克隆至原核表达质粒pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-zot,双酶切鉴定并DNA测序验证。4、将重组质粒pET-32a(+)-zot转化至大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-zot,并用IPTG诱导其表达zot蛋白,利用SDSPAGE分析蛋白产物。5、利用亲和层析柱(Ni-IDAResin)纯化表达蛋白,用Westernblot对纯化蛋白进行鉴定。6、将纯化的zot表达蛋白作用于已贴壁生长的人小肠上皮细胞后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:1、41株ctxAB毒力基因检测阳性的霍乱弧菌检测zot基因为阴性,说明ctxAB和zot毒力基因之间不存在共存关系。2、克隆出了全长约1200bp的霍乱弧菌zot基因编码区,说明PCR扩增zot全基因成功。3、重组质粒双酶切及DNA测序结果显示pET-32a(+)-zot构建成功。4、SDS-PAGE分析表达菌株总蛋白显示在与目标蛋白大小一致的位置出现一条亮的条带,说明zot蛋白表达成功。5、利用亲和层析柱(Ni-IDAResin)获得纯化的重组蛋白,经SDS-PAGE和凝胶成像系统分析,纯化蛋白的分子量约为47kD,浓度为0.324mg/ml,经Westernblot验证重组蛋白为目的蛋白。6、用流式细胞仪检测经重组蛋白作用的人小肠上皮细胞显示zot表达蛋白能引起人小肠上皮细胞的早期凋亡。结论:本论文成功地克隆了zot的全基因,成功构建重组质粒pET-32a(+)-zot,成功构建了重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET-32a(+)-zot,获得zot表达的纯化蛋白,zot表达蛋白能引起人小肠上皮细胞的早期凋亡。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【图文】：

模式图,元件结构,模式图,基因

第 1 章引言析，对霍乱弧菌主要毒力基因和管家基因，如 ctxB 和 tcpA 基因测序，并进行生物信息学分析，均获得了有意义的分析结果。1.3 zot 基因zot 基因编码的小带连结毒素(zonula occludens toxin，zot)是 1991 年 Fasano等发现的毒素，此毒素通过影响细胞间的紧密连接结构或键桥，增加小肠粘膜的通透性，对霍乱弧菌引起的腹泻起辅助作用。zot 基因包含一个 1.3kb 的ORF，位于 ctxA 基因的上游且与 ctxA 基因紧密相临。基因测序表明 CTXΦ 编码的基因排列顺序为 cep、orfU、ace、zot、 zot、ctxA 和 ctxB，因此 zot 基因紧邻于 ctxA 基因的上游（图 1）。ctxA 基因的起始密码子和 zot 基因的终止密码子由 127 个碱基连接，并且 ctxA 基因的起始密码子和 zot 基因的终止密码子重复系列重叠[31]。

基因扩增,特异性引物,从物,自行设计

zot基因扩增图

重组质粒,质粒,载体,基因

3.2.2 重组质粒的酶切分析重组质粒经BamHI和XhoI双酶切后，产生两条带：一条为4.5 kb的pET-32(a+)质粒带，另外一条约为1 200bp的zot带（图3.2）。初步说明zot基因已插入质粒pET-32(a+)载体。

【参考文献】