PON1基因多态性与接受CABG的慢性阻塞性肺疾病患者预后的相关性研究

发布时间：2020-08-18 18:03

【摘要】：冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery heart disease,CHD)发病原因为异常的脂质代谢,在冠状动脉内膜形成粥样斑块,导致血管腔狭窄或堵塞。冠状动脉旁路移植术(CABG)是目前临床上治疗CHD的主要外科治疗手段。CHD常有多种并发疾病,其中包括高血压、心功能不全、糖尿病、以及慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)等。与CHD合并糖尿病或高血压、心功能不全等疾病相比,COPD患者围术期更易发生意外事件,增加患者术后意外事件发生率及死亡率。目前医学界对于CHD合并COPD患者的重视程度越来越高。CHD与COPD具有一些共同的危险因素。在临床上的实际治疗过程中,除了依靠患者病史、体征及相关检查及传统危险因素对疾病进行预测、预防和治疗之外,对一些可能会影响CHD合并COPD患者病情转归、预测急性加重发作频率或者预后情况的相关分子标志物进行深入探索和研究,对于在疾病发生早期进行识别并监测,选择适合的干预手段具有十分重要的意义。同时,对CHD合并COPD患者加以重视,最终能够起到改善此类患者预后,延长其生存期的目的。血清对氧磷酯酶1(serum paraoxonase1,PON1)由人体肝脏合成,由于其抗氧化特性成为目前研究热点。研究发现,PON1对低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)具有保护作用,因此其具有抗动脉粥样硬化的功能。PON1具有抗炎作用。基因型研究以及酶法检测PON1表型研究的结果表明,不同个体之间PON1活性可相差10~40倍。PONI活性的改变与多种疾病的发生和发展之间存在密切联系。糖尿病、家族性高胆固醇血症、心肌梗死等疾病患者血清中PON1活性均发生不同程度的下降。近年来对PON1活性的研究均显示,单纯依靠基因多态性不足以作为完全的冠心病的危险因素,其原因是在冠状动脉粥样硬化患者当中,PON1的活性更为重要,PON1的活性下降引起HDL抗氧化作用发生明显下调。基因多态性是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型基因或等位基因。有调节作用的功能区突变,及邻近位点的突变能够通过影响蛋白质基因表达量,及活性变化,进而影响蛋白质功能。单核苷酸多态性(SNP),即散在的单个碱基的不同,基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於SNP,但更多的是单个碱基的置换。SNP通常是一种双等位基因的或二态的变异。目前大量研究结果显示,PON1基因多态性与多种心脑血管事件的发生和发展有关,其中包括冠心病、缺血性脑卒中、脑梗死等,因此有希望作为预测上述疾病发生的危险因素。近几年来已有大量关于PON1与冠心病关系的研究,但目前尚未有关于PON1基因多态性与冠心病合并COPD患者行CABG术后临床病理参数关系的研究。为此,本研究首次对上述问题进行了探讨。自从研究者们发现miRNA以来,越来越多的证据表明,miRNA与多种疾病的发生和发展之间存在密切联系。在疾病发生部位的组织细胞中,其miRNA表达谱通常相较于机体正常组织细胞存在显著差异。心血管系统有着特别丰富的miRNA,miRNA在心血管疾病中充当多种多样的角色。miRNA在心血管系统的高表达及心肌损伤时的异常表达给心肌缺血疾病的治疗带来了新的方向,研究者期望通过调控miRNA的表达而减轻心肌缺血缺氧损伤。miRNA在心血管疾病中作用及其相关机制的研究尚处于起步阶段。本研究分别对CHD合并COPD患者的PON1基因序列的rs3735590多态性位点等位基因三种基因表型(CC:212;TC:75;TT:5)与行CABG术后的临床病理学参数之间的关系进行探讨,同时采用体外细胞实验的方法研究miR-616与PON1的相关性,旨在为CHD合并COPD患者行CABG术后相关并发症的早期预防和诊断,早期干预治疗提供理论依据。目的为了研究CHD合并COPD患者PON1基因多态性与行CABG术预后的相关性及其作用机制,本研究分别对三种PON1基因型(CC:212、TC:75和TT:5)的冠心病合并COPD患者外周血中PON1的基因型与行CABG后的临床病理学参数之间的关系进行探讨;采用体外细胞实验的方法研究miR-616与PON1的相关性,探讨CHD合并COPD患者体内PON1表达及活性变化的机制,旨在为冠心病合并COPD患者行CABG术后相关并发症的早期预防和诊断及治疗提供理论依据。方法(1)选取2010~2017年于吉林大学中日联谊医院行CABG术的CHD合并COPD的患者共292例。所有入选患者均经冠状动脉造影诊断为冠心病,采集上述患者的外周血样品。提取各血液样品DNA,随后采用酶切法测序确定各样本PON1基因rs3735590多态性位点的基因型,依照其基因型的不同将所有入选患者划分为3组,分别为CC:212组、TC:75组和TT:5组,随后分析了上述三种基因型与患者年龄、性别、总体水平、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等因素之间的关系。采用Kaplan-Meier和Cox回归分析研究了PON1 rs3735590多态性位点基因型是否与CABG术后CHD合并COPD患者无事件存活期有关。(2)分离培养原代人肝细胞,并对其PON1基因型进行鉴定(把PON1 rs3735590 SNP位点TT、TC型合并为一组PON1T,这一组PON1 rs3735590多态性位点基因型等位基因携带T碱基)。应用生物学软件,预测miR-616的靶基因。利用PCR方法,根据PON1基因序列信息设计其3'UTR扩增引物,用PCR方法将PON1基因的3'UTR序列扩增,把扩增产物克隆到含有荧光素酶报告基因的载体之中,突变PON1基因3'UTR序列中的靶点序列,构建含PON1基因3'UTR突变序列的荧光素酶报告基因的质粒(PON13’UTR Mut),对比需要,我们构建野生型含有PON1基因的3'UTR序列荧光素酶报告基因的质粒(PON13’UTR WT)。将不同浓度的miR-616 mimic(25nM,50nM,75nM)分别与含有荧光素酶报告基因的PON13’UTR-WT和PON13’UTR-Mut质粒转染PON1 CC型人肝细胞。检测细胞中荧光素酶的表达水平。分别将miR-NC和不同浓度miR-616 mimic/inhibitor(25 nM、50 nM、75 nM)转染PON1 CC、T型肝细胞,48 h后采用荧光定量PCR和western blot法分别检测细胞中miR-616、PON1 mRNA和蛋白的表达水平,采用ELISA法检测PON1活性。结果(1)t检验结果显示,3组PON1基因型患者在年龄、性别、总体水平和LDL之间均无统计学差异(P0.05),但CC:212组患者的HDL与TC:75组和TT:5组患者相比明显降低(P0.05)。结果表明,与TC和TT基因型相比,CC基因型患者的无事件存活期明显降低(P0.05),表明CABG术后冠心病患者生存期与PON1 rs3735590的多态性位点T等位基因有关。(2)PON1被预测为miR-616的靶基因,miR-616在PON1上结合的位置位于其3’UTR区域。随着miR-616 mimic转染浓度的增高,PON1 WT组细胞中荧光素酶的表达量逐渐降低,呈剂量依赖性;而PON1 Mut组细胞中荧光素酶的表达水平则无明显变化。随着miR-616 mimic转染浓度的增高,PON1 CC型肝细胞中miR-616的表达水平逐渐增高,呈剂量依赖性;PON1 mRNA和蛋白的表达水平逐渐降低,呈剂量依赖性;PON1活性逐渐降低,呈剂量依赖性。随着miR-616 inhibitor转染浓度的增高,PON1CC型肝细胞中肝细胞中miR-616的表达水平逐渐降低,呈剂量依赖性;PON1 mRNA和蛋白的表达水平逐渐增高,呈剂量依赖性;PON1活性逐渐增高,呈剂量依赖性。随着miR-616 mimic转染浓度的增高,PON1 TC、TT型肝细胞中miR-616的表达水平逐渐增高,呈剂量依赖性;随着miR-616inhibitor转染浓度的增高,PON1 TC、TT型肝细胞中miR-616的表达水平逐渐降低,呈剂量依赖性;无论miR-616增高或降低,PON1 TC、TT型肝细胞中PON1mRNA和蛋白的表达、PON1活性均无明显变化(P0.05)。结论冠心病合并慢性阻塞性肺疾病的患者群体,其PON1基因序列中,rs3735590多态性位点为PON1 CC型患者术后无事件存活期更短,预后与CT、TT型患者相比更差;miR-616对PON1 CC型肝细胞中PON1的表达及其活性存在抑制作用,而对PON1 TT、TC型细胞无相应作用,推测这可能是携带PON1 CC基因型的CHD合并COPD患者的PON1活性更低,导致行CABG术后炎症反应程度较携带TC和TT基因型的患者更高,而术后无事件存活期则更短的原因。PON1 rs3735590多态性位点的基因型PON1CC可作为CHD合并COPD患者预后的独立危险因素。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R563.9
【图文】：

冠心病患者,基因型,回归分析,多因素

因为自变量进行多因素 Logistic 回归分析 PON1 基因究结果显示，携带 CC 基因型是 CABG 术后 MACE 的独立为 3.647（1.633~6.275），P=0.016，见表 1-4。PON1 基因多态性与术后 MACE 的多因素 Logistic 回归分析Β SE Wald P 值 RR（95%1.767 0.243 9.160 0.017 3.639（1.622.110 1.291 3.617 0.087 6.919（0.942.229 1.393 4.001 0.100 5.273（0.79因型患者 CABG 术后无事件生存期比较用 Kaplan-Meier 和 Cox 回归分析研究了 PON1 rs373患者无事件存活期有关。如图 1-1 所示，与 TC 和 TT 基的无事件存活率明显降低（P<0.05），表明 CABG 术后1 rs3735590 的多态性 T 等位基因有关。

示意图,倍比,样品,示意图

图 1-1 样品倍比稀释示意图物素化抗体工作液制备：在实验开始前对当次实验所需的生物量进行计算（100 μ/孔），实际配制时应当多配制 100~200μ前 15 min 时采用生物素化抗体稀释液将生物素化抗体原液按释成工作浓度，该试剂要求现配现用。结合物工作液的制备：在实验开始前对当次实验所需的酶结合计算（100 μ/孔），实际配制时应当多配制 100~200μL，在使用采用酶结合物稀释液将酶结合物原液按照 1：100 稀释成工作剂要求现配现用。酶标板上分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，用微量移液器 50 μL 并将之加入至酶标板上的标准孔中，样品稀释倍数为加样操作时应当准确将试剂和样品加入酶标板上相应反应孔的与孔壁接触，待加样完毕后轻轻晃动酶标板使孔内溶液彻底混

标准曲线,靶基因,预测结果

用空白管调零，检测各孔在 412 nm 波长下的吸光度值（OD 值），品的浓度作为横坐标，OD 值作为纵坐标，于坐标纸上绘制出标准依据检测获得的待测样品的 OD 在标准曲线上查找出对应的 PON1 活将获得的活性值乘以稀释倍数即得到样品中 PON1 的活性。统计学分析实验研究中均用 EXCEL 表格录入所有数据，采用 SPSS 19.0 统计学数据。实验数据结果均按照 x±s来表示，两样本间均数比较采用t数比较采用单因素方差分析，当 P<0.05 时表示有统计学意义。果测 miR-616 作用靶点的结果们首先通过生物信息学软件预测了 miR-616 靶点， PON1 基因的 3预测为 miR-616 的一个靶基因（图 2-1）。

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