白蜡虫泌蜡关键基因far2活性分析及ws基因dsRNA体外表达

发布时间：2020-08-23 21:46

【摘要】：白蜡虫Ericerus pela(Chavannes)二龄雄虫分泌的白蜡是用途广泛的天然蜡酯,是多种蜡单酯的混合物。研究表明,蜡酯的合成是由脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-Co A reductase,FAR)将脂肪酸还原成脂肪醇,脂肪酸和脂肪醇在蜡酯合酶(wax synthase,WS)作用下酯化形成蜡酯。前期工作鉴定到了白蜡虫泌蜡候选基因far和ws,但关于far基因的功能等方面还缺少进一步的研究。本研究在获得白蜡虫far2基因c DNA ORF的基础上,采用原核表达FAR2,为单克隆抗体制备提供蛋白;利用昆虫-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)在Bm N家蚕细胞中表达FAR2,收集蛋白FAR2进行体外酶活反应分析,气相色谱(gas chromatography,GC)检测酶反应产物;对蜡酯合成的另一关键酶基因进行原核菌体表达,低成本获得大量ws基因的ds RNA(double-stranded RNA,ds RNA)。主要研究结果如下:(1)白蜡虫FAR2原核表达载体p ET-30a-e GFP/Epel FAR2成功构建,Western blot鉴定FAR2表达成功,SDS-PAGE分析确定IPTG加入量0.8mmol·L-1、诱导时间8h为最佳诱导条件。(2)Bac-to-Bac表达系统的重组质粒p Fast-ie1-FAR2-e GFP成功构建,重组Bacmid获得后转染Bm N家蚕细胞,可观察到大量荧光。Western blot鉴定FAR2成功表达,P2代病毒菌株感染细胞后于不同时间收集蛋白,其Western blot结果表明,细胞感染重组Bacmid后48h是最佳收集蛋白时间。(3)利用收集的白蜡虫FAR2对不同碳链长度脂酰辅酶A进行酶活反应,酶反应产物经GC分析,其结果显示:白蜡虫FAR可将C28脂酰辅酶A还原为C28脂肪醇。(4)采用原核表达系统大量制备白蜡虫ws ds RNA。构建白蜡虫L4440/Epel WS干扰载体,转化后经IPTG诱导获得ws ds RNA的平均量1705ng·m L-1,电泳检测拖尾现象不明显、质量较好。以上研究成功进行FAR2原核表达、真核表达、酶活分析及ws ds RNA的获得,为单克隆抗体制备、生化特性研究奠定了基础,ws ds RNA的体外表达对介壳虫防治具有一定意义。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;S899.1
【图文】：

蜡酯,植物蜡,酯合成,脂肪酸

即由超长链脂肪酸产生醛、烷烃、仲醇及酮糖（图1-1）。如拟南芥角质层蜡大部分通过脱羰基途径产生，只有小部分采用酰基还原途径（Klypina et al., 2008; Doan et al., 2009）。图 1-1 植物拟南芥蜡酯合成途径Fig.1-1 The The synthetic pathway of arabidopsis thaliana.细菌蜡酯合成与植物蜡酯合成的两种方式都有差异，即合成时脂肪酸被还原成脂肪

技术路线图

单克隆,测序,载体,和图

0a-eGFP 载体同时进行 BamHI 和 HindIII 双酶切结果如图2-2A 和图 2-2B。挑取 pET-30a-eGFP/EpelFAR2 阳性单克隆酶切检测如图 2-2C，其测序结果经比对为正确。

【参考文献】