中国水仙类黄酮代谢途径2个R2R3-MYB基因的克隆与功能研究

发布时间：2020-08-23 10:41

【摘要】：中国水仙(Narcissus tazetta var.chineneis)属石蒜科植物,为中国传统十大名花之一,是福建省省花及漳州市市花。但近年来因其品种和花色单一等原因,产业发展陷入瓶颈。黄酮类化合物主要参与植物花色形成,其代谢途径中一系列结构基因的表达受R2R3-MYB等转录因子的调控。本课题以中国水仙'金盏银台'为材料,从中国水仙鳞茎盘转录组数据库中筛选出两条R2R3-MYB转录因子,分别命名为NtMYB5和NtMYB6,使用RT-PCR和RACE技术克隆出这两条基因的全长序列,进行序列分析;通过实时荧光定量PCR技术检测其在中国水仙不同成花时期以及不同组织部位的相对表达水平;构建表达载体并转化农杆菌,进行烟草瞬时表达和烟草稳定转化实验研究基因功能,并分析烟草瞬时表达叶片和转基因植株中类黄酮代谢途径相关结构基因的表达。研究结果将了解水仙类黄酮代谢途径的R2R3-MYB转录因子的功能,为进一步了解类黄酮代谢途径的调控网络提供依据。本研究主要结果如下:1.利用RT-PCR技术从中国水仙花瓣中克隆得到NtMYB5基因编码区序列,序列分析表明该基因开放阅读框全长为681bp,编码226个氨基酸。blast结果显示NtMMYB5与茶树CsMYB4a、柿子DkMYB13、大豆GmMYB5等相似度较高;蛋白多重序列比对分析发现NtMYB5含有R2和R3结构域和一个pdLNLD/ELxiG/s的氨基酸抑制基序;系统进化树分析结果NtMYB5与花青素合成抑制因子聚为一类;通过对NtMYB5在中国水仙不同花期花瓣和副冠以及不同器官的表达,发现NtMYA5表达量在花器官中较高,且随花开放表达量逐渐上升。2.利用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙鳞茎盘中克隆得到NtMYB6基因cDNA序列,序列分析显示获得的序列共1008bp,其中包含完整大小为750bp的开放阅读框,共编码249个氨基酸;blast结果显示NtMYB6与野草莓FvMYB12。通过蛋白多重序列比对分析显示该基因含有R2和R3结构域。进化树结果分析显示该基因同原花青素促进因子亲缘关系较近;NtMYB6基因在在鳞茎盘中的表达量最高。3.构建pSAK277-NtMYB5和pSAK277-NtMYB6基因植物表达载体。首先进行烟草叶片瞬时表达实验,分别将StMYB、NtMYB5+StMYB、NtMYB6、NtMYB6+StbHLH等组合注射烟草叶片,结果显示NtMYB5显著抑制花青素合成促进因子StMYB的效果并下调烟草类黄酮代谢途径中大部分结构基因表达;单独注射NtMYB6基因仅上调烟草PAL和4CL基因表达.4.在稳定转化烟草中,NtMYB5和NtMMY6的表达使得转基因植株花瓣颜色变浅,NtMYB5的效果更加明显。与对照相比,NtMYB5转基因植株花瓣中类黄酮代谢途径大部分结构基因的表达受到抑制,但是黄酮醇分支FLS的表达上调;NtMYB6转基因烟草花瓣中原花青素分支的LAR基因的表达上调。5.以上结果表明,NtMYB5是花青素合成的抑制因子,在中国水仙花中抑制花青素的合成;NtMYB6是原花青素合成的激活因子,可能通过调控关键基因LAR的表达在中国水仙鳞茎盘中促进原花青素的合成。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S682.21
【图文】：

ＷＭＦ５６的克隆、序列分析和表达逡逑单子叶植物，目前对于单子叶植物的类黄酮合较少，本研究通过对中国水仙转录组分析，从中个Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ基因，分别命名为ＭＭ７５５和Ｍ码区全长序列，进行序列分析并研宄它们在中国中国水仙为漳州水仙‘金盏银台’品种，产自其开花后用灭菌过的镊子取出花丝和柱头，将等组织用液氮速冻，保存在－８０°Ｃ冰箱中。逡逑

逦的克隆逡逑３．１．１逦ＲＮＡ质量检测逡逑提取中国水仙的ＲＮＡ经１％凝胶电泳检测后，跑胶结果如图２－２所示。从图逡逑中可以看到清晰的三条条带，且２８ｓ条带宽度和亮度均大于１８ｓ条带，所提ＲＮＡ逡逑无ＤＮＡ污染且没有弥散或拖带现象，说明该ＲＮＡ完整性好，未发生降解，可逡逑以进行余下实验。逡逑经紫外分光光度计检测这些ＲＮＡ的ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２３０ｎｍ值在１．７５－１．８１范逡逑围内，ＯＤ２６０ｒａｎ／ＯＤ２８０ｎｍ值在２．０１－２．０７之间，总体符合后期实验要求。逡逑ＯＤ２６０ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ接近１．８－２．０范围，表示其没有蛋白质污染但有微量异硫氰逡逑酸胍残存，逡逑ＢＢＢＨ逡逑图２－２中国水仙ＲＮＡ电泳图逡逑１Ｐ：花苞期的花瓣；２Ｐ：始花期的花瓣；３Ｐ：盛花期的花瓣；１Ｃ：花苞期的副冠；２Ｃ：始逡逑花期的副冠；３Ｃ：盛花期的副冠；Ｌ：叶片；Ｓ：淲片；Ｂ：淲堇盘逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｐｅｒｉａｎｔｈ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｎａｒｃｉｓｓｕｓ逡逑Ｐ：邋Ｐｅｔ

３．１．２邋ＭＭ７５５保守区克隆与序列分析逡逑将中国水仙花瓣总ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ后，用其作为模板，通过ＰＣＲ扩逡逑增，产物跑胶获得大小约为７００的条带，如图２－３所示。将条带切下，经过回收、逡逑连接、转化、测序，将测序结果与转录组中基因序列通过ＤＮＡＭＡＮ进逡逑行比较，结果二者一致。该基因己在Ｇｅｎｅｂａｎｋ中登陆，登陆号为：ＫＣ７６３９７３．１。逡逑７５０—逡逑ｔ邋？邋Ｈ．ｖ；逡逑■邋？逡逑图２－３邋ＭＭＦＢ５基因扩增产物逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＮｔＭＹＢ５邋ｆｒｏｍ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｎａｒｃｉｓｓｕｓ逡逑将ＭＭＦＢ５序列进行ｂｌａｓｔ，结果显示该基因序列同茶树（Ｃａｍｅ／＆逡逑幻－？洲也尺丫７７４６７６．１）、柿子（＿0故／１；＇５厂位0年；；／７＾}?以尺丫８４９６０７．１）、大豆逡逑（ＧｗＭＹＢ＾ＧＶｙｃ／ｗｅ邋ｗａｘ邋ＮＭ—００１２４８７３３．２）、大丨肥花（ＤｖＭｙＢ２ＤａＭａ／）ｚ’《ｔｔａＭ逡逑ＡＢ６０１００４．１）、桑树（ＭｚＭＴＲ？财Ｍｏｎ＾ａ／ｉａＫＹ６３６４０２．１）等物种的邋ＭＹＢ邋基因逡逑相似性分别为８３％、８３％、８０％、７９％、８０％。这些基因都是类黄酮代谢抑逡逑制因子．逡逑４５｜逦ＤｖＭＹＢ２逡逑１３｜１逦ＭａＭＹＢ３０８逡逑１２ｊ邋Ｉ逦ＶａＭＹＢ３０８逡逑３８邋Ｉ逦■逦ＣｓＭＹＢ４ａ逡逑＂逦９８ｌ逦ＤｋＭＹＢ１３逡逑５３邋逦ＣｃＭＹＢ３０８逡逑■逦２ｍＭＹＢ１１逡逑３０逦0ｇ邋Ｉ逦ｊ－邋ＣｐＭＹＢ４逡逑ｒａｌ—

【参考文献】

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本文编号：2801426