温度对青稞非生物胁迫抗性基因节律性表达的影响研究

发布时间：2020-08-25 08:21

【摘要】：生物钟是一种细胞内源的时间控制系统,它能够帮助生命体“预测”周围自然环境条件在24h内的周期性变化,并使生命体“提前”对环境因子的昼夜变化做出恰当而适时的响应。在植物基因组中,大部分抗逆基因均受到内源生物钟的精细调控。当植物体处于正常生长状态时,内源生物钟会控制大部分胁迫应答基因的表达状态,并使这些胁迫应答基因的整体表达模式表现出与基础代谢活动相协调的昼夜节律性。与之相对应的是,当主要环境因子发生偶然的或处于植物正常生理耐受范围内的轻微改变时,植物内源生物钟系统会通过自身补偿反应保持生物钟系统和植物逆境胁迫耐受系统的运行稳定,从而保证植物体不会对偶发和细微环境变化产生过激的应答反应;而超出生理范围的环境胁迫不仅会显著改变植物生物钟基因的表达模式,而且还会引起相关基因转录产物的差异剪接,最终使得原本受生物钟控制的下游代谢途径发生胁迫应激性的反应,并开启相关的信号传导通路来应对胁迫。禾本科大麦属作物-青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum hook.f.)又称“裸大麦”,是我国青藏高原地区居民栽培的最主要粮食作物。青藏高原地区被认为是现代主要栽培大麦品种的起源地,而青稞则是唯一能够真正适应被称之为“世界屋脊”的青藏高原地区极端气候的大麦属作物,在当地已经有了上千年的人工栽培史。研究者们通常认为,青稞在长期适应低温、缺氧和强紫外辐射的高原生境的过程中,进化出了较强的内源抗逆性系统,并在其基因组中积累了丰富的抗逆基因遗传资源。因为青稞固有的这种生理和遗传特性,使其成为一种很好的研究禾本科植物非生物和生物胁迫耐受性的模式植物。受困于青稞转基因实验体系的不完善,利用青稞突变系研究基因的功能,并分析基因调控的信号通路目前仍然是一项极具挑战性的任务。值得注意的是,近几年随着二代测序技术的发展和普及,青稞及其近缘种栽培大麦都已完成了基因组测序,也实施了某些特定实验条件下的RNA seq转录组测序研究。这些都为采用基因组学手段研究青稞的抗逆性分子机制提供了有力的条件。本论文的主要研究目的是:在变温条件下,对青稞生物钟基因和常见非生物胁迫抗性基因的表达模式进行检测和分析,进而研究环境低温对植物生物钟基因表达节律性和抗逆性基因应激表达调控模式的影响,为研究生物钟调控抗逆基因表达的机理打下实验基础。本论文的主要研究内容如下:1.在非生物胁迫条件下,适用于青稞时序样本荧光实时定量RT-PCR(q RT-PCR)实验的内参基因筛选根据相关文献报道,实验工作首先选择了禾本科相关研究报道中常用的actin、e2、α-tubulin、β-tubulin、gapdh、hsp90、ef-1α、samdc、pkaba1、pgk等10个管家基因,作为进行后续目标基因表达分析时内参基因的候选者。接着利用q RT-PCR实验对上述基因在不同胁迫处理条件下的相对表达量进行了测定。然后使用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper等3种通用软件包对q RT-PCR实验中获得的各候选内参基因相对表达量数据进行表达稳定性分析。研究结果表明,在盐胁迫条件下,hsp90和tubα是最稳定表达的内参基因。而在干旱和低温胁迫条件下,最稳定表达的内参基因分别是act、e2和tubα、ef-1α。最终使用植物核心生物钟基因cca1作为靶基因,对上述基于数学统计获得的内参基因稳定性评估结果进行验证。结果证实,通过综合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper等3个软件统计数据,筛选得到的最适内参基因均能很好地适用于应用q RT-PCR方法分析目标靶基因节律性表达的相关研究。2.青稞生物钟基因和抗逆性相关基因靶序列的选择以及节律性表达模式分析根据拟南芥、水稻、小麦和大麦等植物中已经报道的生物钟相关基因(cca1、toc1、lux、elf3、gi、co1、co2、ft1等)序列,以及应答非生物胁迫响应的抗逆性关键基因(cbf4、nhx1、nhx2、nhx3、cbl2、cbl4、cbl6、cbl8、p5cs、p5cr、cat1、cat2等)的序列,应用Blast在线检索工具,在NCBI核酸数据库中,检索获得大麦(青稞近缘种)核酸数据库中与上述目标基因的同源m RNA序列或c DNA文库EST序列作为本实验中下一步进行节律性表达分析的目标靶序列。获得上述目标靶基因序列后,运用Primer Premier 5.0软件和DNASTAR软件包中的Primerselect模块设计适用于后续q RT-PCR实验要求的引物。并利用半定量PCR对引物的有效性进行验证。研究结果表明,在25℃正常栽培温度条件下的青稞叶片组织内,生物钟基因(如,cca1、toc1、lux、elf3、gi、co1、co2、ft1)和部分抗逆相关基因(如,cbf4、cbl2、cbl4、cbl8、p5cs、p5cr、cat2、nhx1、cmo1、m6pr、sod1、lea3、cmo1、m6pr、sod1 and lea3等)的表达均表现出明显的节律性表型。当环境温度降低到15℃,大部分的上述节律性表达的基因仍然保持了其在正常生长温度下的表达模式。而在温度继续降低到5℃时,原本在常温下呈现显著节律性的相关基因均不同程度失去或减弱了其节律性表达模式。其中,生物钟相关基因的节律性表型均被低温环境打破,而且其在表达峰值时刻的转录水平受到低温环境的显著抑制。大部分抗逆性相关基因的时序表达模式及相对丰度也不同程度的受到低温环境的不利影响。有趣的是,研究中发现青稞cbl4基因的节律性表达模式似乎在短时内不受骤然低温环境的影响,但是在长时低温处理条件下,该基因的节律性表达也趋于丧失。3.在突然施加的低温胁迫条件下,维持节律性表达模式的抗逆性基因Hvcbl4的分子克隆及原核表达根据突然施加的低温胁迫处理不会阻碍青稞Hvcbl4基因在短时的节律性表达模式这一研究结果,研究者推测青稞Hvcbl4基因在骤然低温处理下的节律性调控受到了来自cca1/lhy-toc1反馈环路之外的其他时间线索的影响。为了进一步对该基因的功能进行深入的研究,我们应用RT-PCR方法从青稞中克隆了Hvcbl4基因,并成功构建了携带该基因的原核表达载体p MAL-c2X-Hvcbl4,进而将其转化至表达宿主菌TB1进行诱导表达。诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析证明,该基因在大肠杆菌中能够以融合蛋白MBP-Hv CBL4的形式成功诱导表达。之后,我们将尝试纯化MBP-Hv CBL4融合蛋白,用于制备Hv CBL4蛋白的特异性抗体,为后续Hv CBL4蛋白功能验证工作积累实验基础。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.3
【图文】：

图2-1内参基因表达稳定性分析的基本思路re 2-1 The technology roadmap for the stability analyzing of reference gene expr1 候选内参基因的选择及引物设计据前人的研究报道，通过在线工具 Blast 从 National Institutes of He 数据库选择来自大麦（Hordeum vulgare）的十个已知的管家基因作因。这些基因包括是 act（GenBank：AY145451.1）、e2（AY220735）0042.1）、tubβ6（AM502854.1）、gapdh（AK359500.1）、ef-1α（JN10753（AK368996.1）、pkaba1（AB058924.1）、pgk（AK251528.1）和325266.1）。然后根据这些基因的 mRNA 序列，用 Primer Premie（r版本计用于 qRT-PCR 扩增的引物，并由生工生物工程（上海）股份有2 植物材料处理及时序（time course）样本的收集

西北大学硕士学位论文50μE M 2 s 1，12L/12D 光暗交替照明条件下无菌萌发 10 天。当青稞苗长至 10c左右时，在给予光照开始的同时给予胁迫处理 24h（其中，低温胁迫为 5°C 处理；盐胁迫为 300mM NaCl；干旱胁迫为 15％（w/v）PEG6000）。然后在胁迫处理第2 天，给予光照开始的同时开始每隔 4h 取 0.1g 叶片作为样品，连续取 1 天。所取样品立即放入液氮中，并冻存在-80°C 冰箱直到 RNA 的提取。2.1.4.3 样品总 RNA 的提取以及 cDNA 的合成2.1.4.3.1Trizol 法提取 time course 样本的总 RNA利用改进的 Trizol 法，从 0.1g 冷冻叶样品中提取总 RNA。步骤如图 2-2 所示：

Table 2-5 The contents of RT-PCR reaction systemRT-PCR 反应程序如下：图2-3 RT-PCR 反应程序Figure 2-3 Reaction procedure of RT-PCR实时荧光定量 PCR 反应体系如下：Components The amount of reagentPremix Taq 10μLPrimer 1 0.2μLPrimer 2 0.2μLddH2O 8.6μLcDNA 1.0μLTotal 20.0μL

【参考文献】

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1 来盼;蓝藻prx基因抗氧化功能及其与Kai生物种关联关系研究[D];西北大学;2016年

本文编号：2803485