烟蚜鞣化激素基因的克

发布时间：2020-08-25 12:05

【摘要】：Bursicon是调节昆虫表皮硬化及展翅的激素类蛋白,它在昆虫的表皮硬化和翅的伸展过程中起着关键作用。本研究克隆获得烟蚜Myzus persicae(Sulzer)。Bursicon基因(Burs-α和Burs-β)全长并预测其结构和功能,对这两个基因的进化地位进行分析;通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,q-PCR)技术研究了Bursicon基因在烟蚜不同发育阶段的表达特征,最后利用RNA干扰技术研究Bursicon基因在烟蚜体内的功能。相应结果如下:1.烟蚜不同翅型转录组分析为了丰富烟蚜转录组数据信息,为探明烟蚜翅型分化的分子机制打下基础。本研究利用高通量测序技术Illumina HiSeq~(TM) 2000分别检测烟蚜若蚜、无翅成蚜和有翅成蚜转录组表达差异;通过荧光定量PCR方法,分析翅型相关基因表达模式。结果表明:经过测序获得质量值高于20的碱基比例(Q20)均不低于94%的数据(GenBank登录号:SRR6112438,SRR6112436和SRR6112437);所有reads组装成128 065个unigenes,平均长度607.08 bp;将所得序列注释到NR,NT,KOG,GO和KEGG等数据库进行比对,共有128 065个unigenes被注释。基因表达分析发现,与无翅成蚜和若蚜两者相比,有翅成蚜翅形成、肽类激素和受体蛋白相关基因的表达量存在显著差异。qPCR分析结果显示,在有翅成蚜与无翅成蚜中,Bursicon(Bur-α和Bur-β),Flightin(Fln),Wntless(Wnt),Distal-less(Dll),Decapentaplegic(Dpp),Juvenile hormone epoxide hydrolase基因(JHEH)和Ecdysone receptor基因(EcR)表达量存在显著差异,表明这些基因可能与翅型发育有关。2.烟蚜Bursicon基因全长序列的获得利用RT-PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术进行Bursicon基因进行全长扩增,序列经过DNAstar 5.0拼接得到848 bp Burs-α(GenBank登录号:MF083566)全长cDNA序列和841 bp Burs-β(GenBank登录号:MF083567)全长cDNA序列,将其分别命名为Mpburs-α和Mpburs-β。分析表明,Mpburs-α全长cDNA序列拥有一个完整483 bp的开放阅读框(ORF),共编码160个氨基酸,5端非编码区(5'-UTR)63 bp,3端非编码区(3'-UTR)302 bp,具有真核生物典型加尾信号(AATAAA)和polyA结构;Mpburs-β的全长cDNA序列拥有一个完整417 bp的开放阅读框(ORF),共编码138个氨基酸,5端非编码区(5'-UTR)124bp,3端非编码区(3'-UTR)300 bp,同样具有典型的加尾信号(AATAAA)和polyA结构。3.烟蚜Bursicon基因生物信息学分析对Mpburs-α和Mpburs-β基因全长序列分析,对Mpburs-α和Mpburs-β基因编码的氨基酸及蛋白质进行理化性质和高级结构的生物信息学进行预测分析,结果如下:Mpburs-α和Mpburs-β的相对分子量分别约为17.59 kDa和15.45 kDa,分别由2424个和2148个原子组成,估测理论等电点pI分别为7.96和4.84,化学分子式分别为C_(759)H_(1204)N_(210)O_(232)S_(19)和C_(672)H_(1072)N_(180)O_(212)S_(12);Mpburs-α和Mpburs-β的氨基酸序列与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和麦双尾蚜Diuraphis noxia鞣化激素氨基酸序列一致性最高;Mpburs-α和Mpburs-β基因均有没有跨膜区,但都具有信号肽和磷酸化位点;分子系统进化树分析表明,烟蚜与豌豆蚜和麦双尾蚜亲缘关系较近。4.烟蚜Bursicon基因不同龄期表达分析利用荧光定量PCR技术分析烟蚜在不同发育时期(1龄若虫至刚羽化的成虫)的Mpburs-α和Mpburs-β基因的表达模式。结果显示,Mpburs-α和Mpburs-β基因在烟蚜不同发育阶段表达量不同。其中1龄若蚜表达量最高,4龄若蚜最低。有翅型1日龄成蚜与无翅型相比,Mpburs-α和Mpburs-β基因在有翅型成蚜中表达量均显著高于无翅型成蚜。5.烟蚜Bursicon基因功能分析分别用dsburs-α、dsburs-β和Pbs饲喂烟蚜2龄若虫,观察记录表型变化和死亡率,72 h后收集部分虫体检测靶标基因在烟蚜体内表达情况。结果显示,与饲喂Pbs相比,饲喂dsburs-α和dsburs-β后,Burs-α基因和Burs-β基因在烟蚜体内的表达水平分别下降了67.54%和50.46%,说明Burs-α基因和Burs-β基因的表达明显被抑制。死亡率统计及表型观察发现:当饲喂dsMpburs的最终浓度为15 ng/μl,72h时实验组与对照组的死亡率没有明显差异,但表皮的颜色异常,由红褐色变为淡绿色或透明状,表皮黑化程度明显降低。说明饲喂dsMpburs基因后烟蚜表皮鞣化和黑化作用受到抑制。本文通过烟蚜转录组测序、设计特异性引物、RT-PCR技术、RACE技术成功获得了烟蚜鞣化激素-α和鞣化激素-β基因全长序列,并利用荧光定量PCR以及RNAi技术,研究了它们在烟蚜不同发育时期的表达量变化情况以及在烟蚜生长发育过程中所起的作用,以期为进一步研究烟蚜鞣化激素基因的功能打下基础,为研究以鞣化激素为靶标的新型防治技术提供借鉴。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.3
【图文】：

转导,烟草天蛾,腹部,神经节

图 1.1 鞣化激素激素信号转导假想通路 (Ishaaya et al., 2012)Fig 1.1hypothesized Bursicon signaling pathways鞣化激素功能的实现包括合成和释放两个过程。Reynolds et al.（1983）使法将昆虫体中枢神经系统各区段的匀浆液注射到结扎了的红头丽蝇体内，果表明，神经系统的所有部位均发现鞣化激素。Taghert（1982a, 1982b）细胞生物技术测定烟草天蛾腹部各节神经细胞中的鞣化激素含量发现，每神经节侧面均有 4 个体积较大的能够合成和释放鞣化激素的神经细胞，这被命名为“细胞 24-27”。在进一步的研究发现仅“细胞 27”能合成鞣化激素烟草天蛾不同的生长发育阶段表达量有较大的差异。Luan 等（2006）在蝇的研究中也得到了相似的结论。昆虫幼虫期，鞣化激素只能在腹部神经个“细胞 27”中发现，而到了蛹期的时候，腹部神经节中能表达鞣化激素增至 14 个。研究表明，几乎所有昆虫的鞣化激素从中枢神经系统到血淋放都会经历一个短暂激增的过程。鞣化激素在昆虫神经节中合成后，由神调控翅伸展成熟表皮黑化和成熟对昆虫免疫系统的影响

长度分布,长度分布,转录组,组装质量

贵州大学 2018 届硕士研究生学位论文表 2.3 烟蚜转录组测序序列组装质量Table 2.3 Assembly quality of Myzus persicae transcriptome范(bp)equencelength总数Totalnumber≥500bp≥1 000bpN50 长度(bp)N50length最大长度(bp)Maximamlength最小长度(bp)Minimumlength总长度(bp)Total length平均度Mlen录本ranscript145 200 46 464 23 317 1 477 118 446 201 107 804 096 74nigene 128 065 33 844 14 164 855 118 446 201 77 745 381 60

分类图,分类图,数据库,烟蚜

图 2.2 NR 数据库同源物种分类图Fig. 2.2 Species distribution of homology search of unigenes against the Nr database表 2.4 烟蚜基因注释结果统计Table 2.4 Annotation of unigenes of Myzus persicae数据库Database注释的 unigenes 数目Number of annotatedunigenes注释的 unigenes 百分比Percentage of annotatedunigenesCDD 32 823 25.63KOG 27 755 21.67NR 48 403 37.8NT 48 359 37.76PFAM 28 714 22.42Swissprot 39 320 30.7TrEMBL 48 953 38.23GO 40 556 31.67KEGG 19 995 15.61在至少一个数据库中注释成功

【参考文献】