水稻穗粒数调控基因OsFWL2的功能研究

发布时间：2020-08-25 12:11

【摘要】：随着世界人口的不断增长,粮食短缺已成为一个严峻的世界性问题。水稻是最重要的粮食作物之一,养活了全球一半以上的人口。提高水稻产量,对于满足日益增长的粮食需求、保障粮食安全具有重要意义。fruit weight2.2(FW2.2)是番茄中控制果实大小的一个主效QTL,解释了番茄果实大小变异的30%。研究表明,FW2.2-like(FWL)基因在植物中广泛存在,通过负调控细胞分裂控制器官和果实(种子)的大小,以及参与镉等金属离子的响应。本研究利用新型CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建了水稻FWL2基因2个基因敲除突变体系。表型分析表明,突变体株高等性状与野生型无显著差异,但每穗粒数和单株产量显著高于对照。进一步采用RNA-seq对该基因调控水稻穗粒数的分子机理进行了解析。主要研究结果如下:(1)构建了OsFWL2基因不同靶点的CRISPR/Cas9基因组编辑载体Osfw12a和OsfW12b,利用农杆菌介导法转化粳稻品种中花11,分别获得了 8株和14株转基因阳性植株。突变体基因型分析表明,多数突变类型为少数碱基对的插入或删除。Osfwl2a转基因苗中,1株为纯合突变,占比12.5%,6株为双等位突变,占比75%,1株无突变,占比12.5%;Osfwl2b转基因苗中,3株为纯合突变,占比21.4%,9株为双等位突变,占比64.3%,3株无突变,占比21.4%。两个载体均无杂合突变植株。(2)分别选择Osfwl2a和Osfwl2b载体各一个纯合突变体系作进一步分析。其中,Osfwl2a选择了一个1 bp插入的突变体,命名为osfwl2a;Osfwl2b选择了一个2 bp删除的突变体,命名为osfwl2b。两个突变体携带的突变在后代中均能稳定遗传。进一步利用一对HPT引物和一对sgRNA引物对T1代突变体中的T-DNA结构进行鉴定,成功分离到了无T-DNA插入的纯合突变体。(3)无T-DNA插入的纯合突变体株高、旗叶面积、每株穗数、穗长、每穗一次枝梗数等与野生型无显著差异,但突变体穗粒数与对照相比增加了 14%～18.6%,单株产量增加了 17.2%～17.3%。进一步对每穗二次枝梗数进行分析发现,突变体二次枝梗数增加了10.9%,表明其穗粒数的增加可能是由于二次枝梗数的增加所引起。(4)利用荧光定量PCR进行的表达模式分析表明,该基因主要在发育中的叶片中表达,但在发育中的根、茎、穗和种子中也有一定量的表达,并且其在茎秆、穗子和种子中的表达随着植株的发育成熟而逐渐增强。此外,该基因在叶片和根中的表达均不受镉处理影响,表明其可能不参与镉胁迫的响应。(5)对野生型和突变体枝梗和颖花分化期的幼穗进行转录组测序分析,共鉴定出3406个差异表达基因,其中,1383个为上调基因,2023个为下调基因。KEGG富集分析表明,该基因可能参与植物激素信号转导、光合作用等生理过程。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了水稻FWL2基因的基因组编辑突变体并在T1代即分离获得了无T-DNA插入的纯合突变体,表明CRISPR/Cas9系统是植物尤其是重要作物基因功能研究的有效手段。osfwl2突变体二次枝梗数、穗粒数和单株产量显著增加。进一步转录组测序分析表明,该基因可能通过调控植物激素信号转导等负调控上述重要产量性状。这些结果为该基因的进一步功能研究及在水稻分子育种中的应用奠定了基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511;Q943.2
【图文】：

突变体鉴定,基因组,突变体

３．２逦ＯｓＦＦＺＪ基因敲除纯合突变体的表型分析逡逑对无Ｔ－ＤＮＡ插入的纯合突变体进行表型分析表明，突变体株高、旗叶面积等性状与逡逑野生型无显著差异（图３－２）。对突变体穗部性状进行分析发现，突变体每株穗数、穗长、逡逑每穗一次枝梗数与野生型也无显著差异（图３－３Ｂ－Ｄ），但突变体穗粒数与对照相比显著增逡逑力口（图３－３Ｆ）。其中，（ｗ＞／２ａ平均增加了邋１４％，叫／＾／２６增加了邋１８＿６％。进一步对每穗二逡逑次枝梗数进行调查发现，突变体二次枝梗数增加了邋１０．９％，表明其穗粒数的增加可能是由逡逑于每穗二次枝梗数的增加所引起（图３－３Ｅ）。最终，突变体的单株产量平均增加了逡逑１７．２°／。￣１７．３％邋（图３－３Ｇ）。然而，突变体种子大小与野生型无显著差异。这些结果表明该逡逑基因可能参与水稻穗粒数和产量的调控。逡逑３．３逦表达模式分析逡逑Ｘｕ等＿利用半定量ＰＣＲ分析了逦基因在７个组织器官中的表达模式，发现该逡逑基因主要在抽穗期的旗叶和根中表达。本研宄进一步采用荧光定量ＰＣＲ分析了该基因在中逡逑花１１邋１４个不同组织器官和发育阶段的表达模式，发现该基因主要在发育中的叶片中表达，逡逑但在发育中的根、茎、穗和种子中也有一定量的表达

照片,突变体,穗部,表型

ｉｓ逡逑迫的抗性。本研究不同浓度镉处理下的分析表明，该基因在叶片和根中的表达均没有显著逡逑差异（图３＿４Ｂ），说明该基因可能不参与镉胁迫的响应。逡逑ＩＭｉ邋ＬＵ邋Ｌ逡逑中花邋１１逦ｏｓｊｗｌｌａ逦ｏｓＪｗｌ２ｂ逦？逡逑图３－２逦突变体植株表型逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｏｓｆｗｌｌ邋ｍｕｔａｎｔｓ逡逑Ａ：植株照片；Ｂ：突变体株高，ｎ＝１０；邋Ｃ：突变体旗叶面积，数值为１０棵植株的平均值逡逑＿＿逡逑Ｉｍｈｉｉ邋１１ｉ１逡逑中花邋１１邋ｏｓｆｗｌ２ａ逦ｏｓｊ＼＼！２ｂ逦＾逦＾逦＾逦令掌邋＾逡逑图３－３逦突变体穗部表型逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ邋ｏｆ邋ｏｓｆｗｌ２邋ｍｕｔａｎｔ邋ｐａｎｉｃｌｅｓ逡逑Ａ：突变体稻穗，比例尺＝５邋ｃｍ；邋Ｂ：突变体每株穗数，ｎ＝１０；邋Ｃ－Ｆ：突变体穗长、每穗一次枝梗数、每穗二次枝梗数和逡逑每穗粒数，数值为６棵植株的平均值；Ｇ：单株产量，ｎ＝１０逡逑

照片,突变体,表型,植株

【参考文献】