克氏梭菌己酸合成途径基因的鉴定及该菌遗传操作工具的构建

发布时间：2020-08-25 20:13

【摘要】：克氏梭菌是重要的己酸合成菌,己酸合成效率在众多己酸合成微生物中名列前茅。但长期以来,克氏梭菌的己酸合成途径关键酶编码基因并未得到鉴定,同时缺乏克氏梭菌的遗传操作系统,难以对克氏梭菌展开代谢工程改造研究。本课题将解析克氏梭菌己酸合成途径的关键酶编码基因,对于克氏梭菌产己酸关键基因中硫解酶编码基因功能进行解析。通过构建克氏梭菌遗传操作工具,实现对克氏梭菌的己酸合成途径代谢工程的改造。具体内容包括:(1)克氏梭菌发酵动力学显示,当以乙醇和乙酸为底物,克氏梭菌的主要代谢产物为己酸,仅合成少量的丁酸和微量的辛酸;当以乙醇和丁酸根作为碳源时,克氏梭菌产生己酸和微量的辛酸,丁酸呈现出净消耗。克氏梭菌脂肪酸合成酶系同时具有催化丁酸合成和己酸合成的能力,而酶的体内催化功能受初始碳源种类的调控。克氏梭菌产己酸关键基因的转录分析表明,在己酸合成过程中,各个酶编码基因呈现不同的转录水平和时序性。硫解酶编码基因(thlA1)和3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶编码基因(hbd1)转录水平最高。(2)克氏梭菌具有三个硫解酶编码基因(thlA1,CKL_3696;thlA2,CKL_3697;thlA3,CKL_3698)。通过转录组测序结合反转录-荧光定量RCR对三个硫解酶编码基因的表达水平和时序表达特征进行了分析。在菌体生长稳定期之前,thlA1基因维持恒定表达,thlA2基因表达时序上调,thlA3基因表达时序下调。当菌体生长进入衰亡期,三个硫解酶编码基因转录水平迅速下调。可见,三个硫解酶编码基因的表达严格依赖于菌体生长。硫解酶对(碳四)乙酰乙酰辅酶A的酶动力学测定结果表明,克氏梭菌三个硫解酶对于四碳底物均显示出相似的底物亲和力(K_m),ThlA1对四碳底物的催化效率(k_(cat)/K_m)低于ThlA2和ThlA3。(3)本研究针对克氏梭菌典型菌株DSM555,通过抗性筛选、电转条件优化、复制子选择、启动子选择等成功构建了克氏梭菌遗传操作工具(基因过表达系统),实现了将外源基因在克氏梭菌体内的表达。在克氏梭菌体内过表达了丙酮丁醇梭菌来源的醇醛脱氢酶编码基因(adhE2),adhE2过表达菌株产丁醇25 mg·L~(-1),己醇155 mg·L~(-1)。过表达菌株的丁醇和己醇浓度分别比野生型菌株高2.5倍和8.2倍。基于以上结果本研究得出,克氏梭菌具有三个有催化活性的硫解酶,在克氏梭菌体内均呈活跃表达。本论文成功构建出了克氏梭菌基因过表达系统,将促进对克氏梭菌的己酸合成机理研究及其代谢工程改造。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78
【图文】：

己酸,丁酸,代谢途径,酶促反应

第一章绪论菌展开代谢工程改造。因此本课题将对克氏梭菌己酸合成途径的关键酶编码基因进行解析，通过发酵动力学、体内表达水平和体外酶学性质三个方面对克氏梭菌产己酸关键基因及合成六碳骨架的关键酶硫解酶功能进行解析。该研究结果可以为 C6 平台化合物(如己醇、3-羟基己酸)的绿色生物合成提供高效的基因元件。本文首次探索构建克氏梭菌遗传操作工具，为实现对克氏梭菌的己酸合成途径代谢工程改造奠定理论和技术基础。

抗性基因,甲基转移酶,硫解酶,壮观霉素

江南大学硕士学位论文和测序验证获得阳性克隆。将连接有 lacZ 基因的质粒转化入克氏梭菌 DSM555 菌株中，以含有 10 μg·mL-1甲砜霉素的乙醇醋酸钠琼脂平板筛选阳性转化子。引物 p6-F/lacZ-BamH I-R 进行菌落 PCR 验证阳性转化子，菌株命名为 DSM555(PthlA1(part)-lacZ)、DSM555(PthlA1(all)-lacZ)和 DSM555(lacZ)，见图 2-1。

曲线,丁酸,底物,乙酸

丁酸、己酸和辛酸摩尔比为 3:41:1，质量比为 2:33:1(图3-1)。在此培养条件下，克氏梭菌的主要代谢产物为己酸，仅合成少量的丁酸和微量的辛酸。基于克氏梭菌己酸发酵动力学特征，我们推测克氏梭菌的短中链脂肪酸合成酶系倾向于催化四碳和六碳产物的形成。发酵动力学分析还表明，丁酸呈现出先合成，再被利用的特征。丁酸之所以能被回用，推测存在两种可能性：(1)辅酶 A 转移酶(Cat)具有较为广泛的底物特异性[10]，Cat 可以将辅酶 A 转移到乙酸上生成乙酰辅酶 A，也可以将辅酶 A 转移到丁酸上，生成丁酰辅酶 A；(2)Cat 催化的丁酸释放反应为：丁酰辅酶 A+乙酸丁酸+乙酰辅酶 A，当乙酸被逐渐消耗后，该反应可能倾向于逆向进行，丁酸被回用。无论哪种途径，丁酸均可以被转化为丁酰辅酶 A，与一分子乙酰辅酶 A 在硫解酶催化下形成 3-酮基-己酰辅酶 A。图 3-1 克氏梭菌 DSM555 利用乙醇和乙酸作为碳源的生长、底物利用和产物生成趋势(A：克氏梭菌生长曲线；B：克氏梭菌底物利用曲线；C：克氏梭菌产物曲线)Fig. 3-1 The profiles of growth, substrate utilization and metabolite production in a batch fermentation ofC. kluyveri DSM555 using ethanol and acetate as carbon sources (A: growth curve of C. kluyveri; B:substrate utilization curve of C. kluyveri; C: product curve of C. kluyveri)当以乙醇和丁酸根作为碳源时，克氏梭菌产生己酸和微量的辛酸，丁酸呈现出净消耗，无乙酸被检测到(图 3-2)。可见

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