LPS诱导下池蝶蚌免疫相关基因LBP、TLR4、MyD88和AP-1的表达分析以及TLR4和MyD88互作关系

发布时间：2020-08-25 22:49

【摘要】：本文针对优质淡水珍珠蚌池蝶蚌基于LPS诱导下MyD88依赖途径的免疫相关基因分子结构特征、组织表达规律以及互作关系进行探究。以池蝶蚌性腺转录组中部分cDNA序列设计引物,通过RACE-PCR技术获得池蝶蚌LBP、TLR4、MyD88和AP-1(以下分别简称HsLBP、HsTLR4、HsMyD88、HsAP-1)四个基因的cDNA全长,结果显示,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1的cDNA全长分别为1885bp、3519bp、1863bp和1641bp,分别含有1506bp、2694bp、1428bp和888bp的最大ORF。HsLBP、HsTLR4和HsAP-1的3’UTR均含有“AATAAA”的加尾信号。生物信息学分析显示,HsLBP和HsTLR4的蛋白质N端都有一段信号肽,属于分泌蛋白或跨膜蛋白;HsLBP蛋白含有BPI1和BPI2两个结构域;HsTLR4蛋白含有LRRs和TIR两个保守的结构域和一段螺旋结构的跨膜域;HsMyD88蛋白含有DD和TIR两个结构域;HsAP-1蛋白含有Jun-like transcription factor和BRLZ结构域。Neighbor-Joining系统进化树分析显示:HsLBP与三角帆蚌的HcBPI/LBP1同源性最高,相似性和一致性高达98%;HsTLR4与虾夷扇贝的MyTLR3同源性最高,一致性达45%,相似性达62%,而HsTLR4-TIR与人的TLR4具有最高的相似性和一致性,分别为44%和25%;Hs MyD88与三角帆蚌的HcMy D88-2同源性最高,相似性和一致性高达99%;HsAP-1与菲律宾蛤仔的RpAP-1同源性最高,相似性和一致性分别为69%和60%。在池蝶蚌中,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1均能在多种组织(血细胞、心脏、肝胰腺、外套膜、肾脏、鳃、闭壳肌、斧足、性腺和肠)中表达,具有表达普遍性。HsLBP mRNA主要在鳃、血细胞和肝胰腺中表达,在斧足和闭壳肌中的表达量较低;HsTLR4和HsMyD88 mRNAs均主要在鳃和肝胰腺中表达,在血细胞和外套膜中的表达量较低;HsAP-1 mRNA主要在肝胰腺中表达,在外套膜中的表达量较低。LPS诱导后,HsLBP mRNA的表达水平在6h时间点出现下调,而在12h时间点开始出现显著上调(p0.05);HsTLR4和HsMyD88 mRNAs表达模式类似,均在6h时间点表达水平出现显著上调(p0.05),在鳃中表现的最为明显;HsAP-1 mRNA表达水平在6h时间点开始出现显著上调(p0.05),在血细胞中表现最为明显,为极显著上调(p0.01)。本文对HsTLR4和Hs MyD88之间的关系作了进一步的探究。首先,根据酵母双杂交的原理探讨了HsTLR4和HsMyD88之间存在直接的相互作用;其次在人肝癌细胞SMMC-7721中使用双分子荧光互作实验进一步证明了HsTLR4和HsMyD88之间存在直接的相互作用;并且进一步采用双分子荧光互作实验来探究它们的结构域之间的关系,结果显示,HsTLR4的TIR结构域可以和HsMyD88的Death结构域或TIR结构域发生相互作用,但TIR-Death之间相互作用发出的绿色荧光强度要比TIR-TIR之间的弱;同时通过GST-pulldown和western blot实验证明,HsTLR4和Hs MyD88之间能够相互作用,并且TIR-Death之间也能发生相互作用,TIR-Death结构域间发生的相互作用可能是因为微小的静电作用而导致。本论文通过RACE-PCR在池蝶蚌血细胞和鳃中克隆得到先天免疫相关基因HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1的cDNA全长,进行生物信息学和系统进化树分析发现,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1具有保守性;LPS诱导后,HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1的mRNA表达水平出现显著上调。同时通过酵母双杂交、双分子荧光互作和GST-pulldown等证明HsTLR4和HsMyD88之间能够直接发生相互作用,并且主要是通过TIR-TIR结构域之间相互作用而产生的。本研究首次在池蝶蚌中发现并鉴定了HsLBP、HsTLR4、HsMyD88和HsAP-1四个基因,并且在淡水贝类中首次揭示了HsTLR4能够与HsMyD88直接发生相互作用。因此,在池蝶蚌中存在应答于LPS的HsMyD88依赖信号通路。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

图 1.1 TLRs 的胞外域 LRRs 的结构(a)和 TLRs 的结构(b)[20]Fig. 1.1 Structure of extracellular domains LRRs of TLRs (a) and structure of TLRs (b)[20]1.3 TLRs 种类及其功能

所有TLRs识别病原微生物的PAMPs后，通过招募并激活含有

图 1.2 TLRs 信号通路示意图[55]Fig. 1.2 TLRs signal path schematic[55]1.4 TLR4 在哺乳类中信号通路

【参考文献】

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本文编号：2804305