通过权重基因共表达网络鉴定与膀胱癌病理特征及临床预后相关的分子标志物

发布时间：2020-08-25 23:25

【摘要】：第一部分通过WGCNA筛选与人膀胱癌病理有关的分子标志物目的:通过权重共表达网络分析(WGCNA)研究与膀胱癌临床病理分级有关的差异基因及有关信号通路。方法:从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库网站下载人膀肮癌RNA二代测序原始数据。在R软件中调用affy包,limma包和WGCNA包对芯片测序数据进行处理。构建表达矩阵,对样本数据进行分层类聚并筛选低级别(Ta-Tl)和高级别膀胱癌(T2-T4)之间的差异表达基因(Differentially expressed gene,DEG)。采用WGCNA函数包完成离群样本和基因的剔除,实现无尺度共表达网络的构建和基因模块的鉴定,在模块-特征关系图中寻找存在最高相关性的基因模块和相应的临床特征。基于基因显著性和模块身份,WGCNA函数包中networkScreening函数用于筛选目标模块的枢纽基因。枢纽基因(hub genes,HG)和相应临床特征的相关性通过单因素方差分析和独立样本的T检验来检测,并由验证阵列的数据证实目标模块的保守性,以及枢纽基因与临床特征的相关性。在STRING数据库中,使用Cytoscape工具,构建枢纽基因蛋白互作网络。在DAVID数据库中,使用注释工具对枢纽基因行GO(Gene Ontology)功能注释并行KEGG分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)。结果:生物信息学方法处理膀胱癌芯片数据,从93个样本数据里,鉴定出874个上调基因,420个下调基因。发现103个网络枢纽基因,其中4个是蛋白互作网络枢纽节点,COL3A1基因与肿瘤进展具有较高的相关性,功能和通路富集分析证实COL3A1基因高表达与MAPK信号通路和粘着斑相关通路(focal adhesion related pathways)具有较大相关性(FDR0.05)。结论:生物信息学权重基因共表达网络分析证实COL3A1基因与膀胱肿瘤发生、发展可能具有密切关系。第二部分数据挖掘结合临床样本验证COL3A1表达与膀胱癌临床预后及病理的关系目的:从组织学和临床信息资料基础上验证COL3A1 mRNA及蛋白表达水平是否与膀胱癌预后及病理特征相关。方法:执行线性回归分析来验证测试数据集中的枢纽基因。基于Ocomine数据库进行分析COL3A1在正常膀胱癌和膀胱癌中表达的差异。从GEPIA数据库中获得数据来执行Kaplan-Meier生存曲线分析COL3A1与膀胱癌进展的关系。基于芯片数据集进行COL3A1与膀胱癌生存分析和其与各临床预后指标的ROC曲线分析。分别收集和保存本院临床膀胱癌根治术后的膀胱癌和癌旁组织样本。将收集的膀胱癌和癌旁组织样本制成组织芯片,再采用免疫组织化学方法检测各样本膀胱癌和癌旁组织中COL3A1蛋白表达水平。使用qRT-PCR方法检测收集的膀胱癌和癌旁组织中COL3A1基因mRNA的表达量。结果:线性回归分析结果显示:COL3A1与膀胱癌临床分期具有强相关性(p0.001)。基于Ocomine数据库分析发现COL3A1基因的表达不仅仅在正常膀胱癌中高表达,而且与膀胱癌进展有着强相关性。根据GEPIA数据库的Kaplan-Meier生存曲线分析发现:在膀胱癌组织COL3A1高表达的病人里,其总生存时间和无病生存期是显著缩短的。测序芯片生存分析和ROC曲线分析也提示COL3A1表达与相关临床预后指标有关。qRT-PCR结果显示膀胱癌组织中COL3A1 mRNA的表达量要比癌旁组织显著提高(p0.01),组织芯片免疫组织化学结果提示高级别膀胱癌组织中COL3A1蛋白高表达水平比低级别膀胱癌患者升高。结论:COL3A1高表达与膀胱癌的发生和进展密切相关。第三部分敲低和过表达COL3A1对膀胱癌细胞系生物学行为的影响目的:从细胞分子层面研究COL3A1与膀胱癌细胞生物学行为的相关性。方法:通过COL3A1shRNA质粒瞬时转染膀胱癌细胞株EJ和UMUC3,从而构建EJ-shNC,UMUC3-shNC 以及 EJ-shCOL3A1,UMUC3-shCOL3A1 细胞株模型。EJ 细胞转染pcDNA3.1构建质粒过表达COL3A1组和空载质粒组。采用细胞增殖-毒性检测实验(MTT)来检测不同细胞株的增殖能力。采用平板克隆形成实验检测不同细胞株的平板克隆形成能力。应用细胞划痕实验和transwell小室检测各组细胞的迁移能力。应用流式细胞仪检测各组细胞的周期、凋亡情况。用westernblot方法检测细胞的MAPK和EMT相关蛋白的表达水平。结果:通过shRNA技术敲低膀胱癌细胞株EJ中COL3A1的mRNA及蛋白表达水平,MTT、平板克隆实验发现EJ-shCOL3A1细胞株的增殖能力明显降低,流式细胞术发现敲减COL3A1能阻滞膀胱癌细胞的增殖周期,增加膀胱癌细胞的凋亡率。细胞划痕试验也证实COL3A1与膀胱癌细胞系EJ和UNMUC3的迁移能力有关。COL3A1蛋白敲减的EJ细胞中MAPK和EMT相关蛋白的表达水平也受到影响。COL3A1过表达能增加UMUC3的增殖活性。结论:在细胞分子实验层面证实了 COL3A1与膀胱癌细胞的增殖迁移能力有关,进一步佐证COL3A1与膀胱癌的进展有关。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14

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本文编号：2804337