棉花GhFAD2基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-08-26 05:16

【摘要】：目的:在植物脂肪酸合成代谢过程中,Δ12脂肪酸去饱和酶基因FAD2是控制油酸脱氢合成亚油酸的关键酶基因。在油料作物中,油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)是种子油脂中的主要脂肪酸组分,其在油料作物种子中的相对比例决定了食用植物油的营养价值与氧化稳定性。棉花既是最重要的纤维作物,又是重要的油料作物。克隆棉籽中特异高效表达的FAD2基因,并对其深入研究,有利于采用脂肪酸代谢基因工程技术对棉仁中脂肪酸成分进行定向修饰和改造。方法:(1)在已知GhFAD2氨基酸序列(GenBank X97016)的基础上,从棉花基因组数据库中电子克隆获得GhFAD2家族基因,并对其进行生物信息学分析;(2)利用qRT-PCR技术分析GhFAD2基因家族在棉花不同组织和种子不同发育时期中的表达特性;(3)利用索氏提取法(石油醚法)提取不同发育时期棉籽中的总油脂,并通过GC-MS测定花后5-60天(DPA)的12个不同发育阶段棉籽的样品,分析棉籽中特异高效表达的GhFAD2在棉籽不同发育时期中mRNA表达水平与C18:1/C18:2比值;(4)用波通近红外扫描仪无损伤测定566份陆地棉品种(系),筛选出高(20%)、中(17%-19%)、低(11%-16%)油份的棉花材料,进而测定其各脂肪酸组分的相对含量,分析GhFAD2表达水平(油酸/亚油酸的相对比例)与棉籽的油脂含量的相关性。(5)通过同源技术克隆获得棉籽中特异高效表达的GhFAD2-1,利用Gateway技术构建35HK-GhFAD2-1植物干扰表达载体,用DNA重组技术构建pBI121-GhFAD2-1植物超表达载体,分别转化模式植物拟南芥和新陆早33号,分析GhFAD2-1的功能。结果与结论:1.利用生物信息学方法,从棉花基因组数据库中电子克隆获得GhFAD2家族基因。GhFAD2基因在A基因组和D基因组中均有4个拷贝,分别命名为GhFAD2-1A、GhFAD2-1D、GhFAD2-2A、GhFAD2-2D、GhFAD2-3A、GhFAD2-3D、GhFAD2-4A、GhFAD2-4D。通过序列分析可知,GhFAD2基因编码区连续均无内含子序列,棉花的同一FAD2基因在A基因组与D基因组的序列高度一致。2.qRT-PCR结果表明,GhFAD2-1/2/3/4基因在不同组织中都存在差异,GhFAD2-1基因在发育中的种子中特异高效表达,而在其它组织中表达量很低。GhFAD2-2基因在陆地棉各组织中都有表达,但表达量很低。GhFAD2-3和GhFAD2-4基因同源性高达98.44%,在所有组织中均有表达,包括根、茎、叶片、花和种子。3.利用qRT-PCR技术分析发现GhFAD2-1基因在棉籽发育呈先升高后降低的趋势,40DPA是其表达峰值。使用GC-MS气相色谱-质谱联用仪测定其脂肪酸组成,结果分析表明油酸/亚油酸比值与FAD2-1基因表达呈负相关。通过对陆地棉材料脂肪酸组分分析发现,种子含油量与棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等脂肪酸的相对百分含量没有显著相关性。GhFAD2-1基因在种子中的表达水平决定了油酸/亚油酸的相对比例,但与棉籽的油脂含量并没有明显的相关性。4.采用同源克隆技术获得了棉花品种“新陆早33号”的GhFAD2-1基因。该基因编码区全长1158bp,共编码385个氨基酸。将构建的35HK-GhFAD2-1干扰表达载体转化模式植物野生型拟南芥,超表达载体pBI121-GhFAD2-1转化fad2突变体拟南芥(CS8041),筛选获得GhFAD2-1转基因的纯合体。超表达转化突变体基因株系中油酸的含量有所降低,并且亚油酸的含量增加。而GhFAD2-1基因在野生型拟南芥中干扰表达抑制了拟南芥内源FAD2-1基因的表达,因此表现为同突变体相似的性状。5.将已构建的pBI121-GhFAD2-1超表达载体,干扰载体35HK-GhFAD2-1通过农杆菌介导法侵染棉花新陆早33号下胚轴,获得棉花阳性植株,为进一步在分子水平上研究GhFAD2-1的表达与调控机制,进而为棉籽油的品质改良奠定基础。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562
【图文】：

脂代谢,棉籽,脂肪酸合酶,酰基载体蛋白

棉花 GhFAD2 基因的克隆及功能分析首先被运送到质体中，经过脂肪酸合酶（Fatty acid synthase）缩合、还原、脱进行碳链延伸；然后在硫酯酶的作用下，合成脂酰基并从酰基载体蛋白（Acyl Cin，ACP）上释放出来；FA 被运送到内质网（Endoplasmic reticulum，ER），甘油（3－phosphoglycerate）缩合成 TAG 最后，新和成的 TAG 被运输至油体镜岩等，2004）。棉籽油酯组分与基因的关系

基本特性

图 1-2 FAD2 的基本特性Fig. 1-2 The basic features of FAD2A FAD2 催化油酸脱氢合成；B FAD2 定位于内质网；C FAD2 定位于质体膜A FAD2 catalyzes the dehydrogenation of oleic acid; B FAD2 is positioned on the endoplasmic reticulum; C FAD2 ispositioned on the plastid membrane1.2.2Δ12 脂肪酸去饱和酶的结构及特性油酸脱饱和酶，共 458 个氨基酸，其对应的蛋白质约为 52kDa，与其他的去饱和酶相比较有保守的三个组氨酸box以及膜结合酶特性的疏水性跨膜结构域，N端区域约100个氨基酸。N-末端测序发现富集的重组蛋白，具有植物微粒体细胞色素 B5 的氧化还原吸收光谱特征（Sperling P，1995）。Δ12 酰基脂质脱氢酶在大肠杆菌中超表达，结果发现，过表达蛋白与细胞膜有关，约占细胞总蛋白的 10%，占总膜蛋白的 25%（Panpoom S，1998）。哺乳动物 FAD2 家族的基因组结构分为三个亚型，FADS1、FADS2、 FADS3。然后我们研究了猪 FADS1 转录起始位点并鉴定了一种新的基因亚型，命名为 FADS1b。进化

花生四烯酸,亚油酸,脂肪组织

图 1-3 亚油酸合成花生四烯酸Fig.1-3 Linoleic acid synthesis of Arachidonate.转运血浆中疏水的脂肪。血液中循环利用的脂蛋白脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)和 HDL(高密度脂蛋白形成过程中由 VLDL 衍生而来的。脂肪酸是细胞内的储存于脂肪组织中。用于贮存脂肪的脂肪酸主要以形式被转运入脂肪组织。乳糜微粒在脂肪组织中被环中，被肝脏吸收。VLDL 在脂肪组织中被降解成醇的脂蛋白而循环。HDI.是可被不断循环利用的脂为胆固醇酯的磷脂酰胆碱胆固醇酰基转移酶(或卵磷l Keys 等在马德里进行的一项研究发现，40-49 岁的们的总脂肪摄入(主要是单不饱和脂肪酸)占每日总能牙并不常见（Ancel Keys et al，1953）。研究发现，增加膳食摄入单不饱和脂肪酸 OA,能降低

【参考文献】