全外显子组测序发现两个孟德尔遗传疾病家系的致病基因及其功能研究

发布时间：2020-08-26 16:56

【摘要】：目前,精准医疗在我国迅速发展,而挖掘疾病的致病基因,探索基因的功能,了解其致病机理,是迈向精准医疗需要经历的过程。遗传家系资源为探索致病基因和疾病之间的关系提供了宝贵的证据支持。过去对孟德尔遗传疾病的分析是采用全基因组家系连锁分析进行精细定位、候选基因Sanger测序验证的方法。然而由于受谱系资料完整度、疾病外显率、延迟显性以及分子标记多态性的影响,往往找不到目标区域、定位区域错误或不精确。随着高通量测序技术的出现,加速了致病基因的发现。本项研究基于全外显子组测序技术,鉴定了两个孟德尔遗传疾病家系的致病基因及突变,并对基因及其突变的功能进行了研究,强调了测序技术与临床检查相辅相成,对探究基因——表型的重要性,提出了新的致病分子机制,为疾病的精准医疗提供了新的启示。本研究的第一部分对一个具有早发性病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,SSS)、心脏传导系统障碍(cardiac conduction disorder,CCD)、扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)和心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)的三代家族进行两次随访,发现该家系患者猝死率高(60%),患者猝死时年龄低,最低年龄30岁,平均年龄39岁,患者疾病进程存在临床异质性。对家系成员采用全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)进行致病基因和突变的鉴定。确定了核纤层蛋白A/C(lamin A/C,LMNA)基因(NM_170707.3/NM_005572.3)中的新型移码突变LMNA(c.1433dupT,p.Leu478Phefs*74)是引起该家系患者心脏疾病的致病突变。LMNA基因移码突变引起疾病的分子机制并不完全清楚。本研究通过氨基酸预测分析,认为该移码突变可能引起lamin A/C产生截短蛋白,引起免疫球蛋白(Ig)结构域的破坏。通过全细胞膜片钳技术,在HEK/Na_v1.5细胞中过表达LMNA(c.1433dupT)突变质粒发现与野生型lamin A相比LMNA(c.1433dupT)表达的截短蛋白可引起钠电流密度显著降低,而恢复、激活、失活曲线均没有变化。首次发现其机制是引起细胞膜上Na_v1.5离子通道数量显著减少,对全细胞中Na_v1.5离子通道数量没有影响。共聚焦荧光显微镜显示LMNA截短蛋白定位发生变化,呈小点状聚集在细胞核内部且细胞核形态受影响呈挤压状,核周围皱缩。本研究鉴定了一例LMNA新型移码突变,引起家族性常染色体显性遗传性SSS、CCD、DCM以及SCD。综合以上结果,本研究认为该LMNA移码突变产生的截短蛋白p.Leu478Phefs*74具有负显性效应,包括影响钠电流密度、细胞膜上Na_v1.5离子通道数量、影响lamin A/C自身的组装分布以及细胞核结构稳定性。这些负显性效应和单倍剂量不足可能共同引起了疾病的发生发展,这对于理解LMNA基因的临床异质性、引起多种心律失常和猝死提供了解释,具有重要意义。本研究的第二部分对一个11人的Amish家族进行分析,发现3个兄妹在新生儿期患有严重的眼睛疾病,症状表现为畏光、眼球震颤和视网膜营养不良,并且疾病以常染色体隐性方式遗传。采用全基因组连锁分析和全外显子组测序的方法寻找该家系的致病突变。首先,在基因组上每隔10 cM选择1个微卫星标记(simple sequence repeat,SSR),对406个SSR标记进行了全基因组连锁分析,在2q11区域发现了一个显著相关的多态标记D2S2216,2点LOD值为1.95,多点LOD值为3.76(达到显著连锁水平)。通过单体型分析发现,与疾病表型共分离的区域位于2p14-2q14之间。之后,对家系中3个患者进行全外显子组分析,发现细胞周期蛋白和CBS结构域二价金属阳离子运输调节因子4基因(cyclin and CBS domain divalent metal cation transport mediator 4,CNNM4),存在一例纯和无义突变(c.1813CT,p.R605X),并且该基因也位于2p14-2q14区域。由于CNNM4基因突变在此之前报道导致Jalili综合征,而在最初的家系收集和临床诊断检查时并没有注意到牙齿病变的症状,当鉴定出Jalili综合征致病基因CNNM4突变之后,对家系成员进行了回访,发现患者均具有牙齿畸形的症状,符合Jalili综合征的临床表型。该CNNM4(p.R605X)突变是在Amish人群中首次报道的具有奠基者效应(founder effect)的突变。Jalili综合征的致病分子机制仍不明确。本研究发现CNNM4和IQCB1相互作用,而IQCB1突变后会导致先天性黑朦(Leber Congenital Amaurosis,LCA)。截短的CNNM4蛋白(p.R605X)显著地增强了和IQCB1的相互作用,并增加了细胞凋亡。推测CNNM4(p.R605X)引起Jalili综合征可能是通过以下几种途径之一或者共同作用:无义介导的mRNA降解机制、影响IQCB1的功能以及引起细胞凋亡。本研究首次将Jalili综合征致病基因CNNM4和LCA致病基因IQCB1在功能水平联系起来,这对于解析Jalili综合征视网膜病变的分子致病机制具有重要的意义。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R596
【图文】：

流程图,平台基,测序,流程

图1. SOLiD 测序平台基本流程（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/）Figure 1. SOLiD sequence platform and process flowcha （ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/）双碱基编码原理如图 2b 所示。进行连接测序反应时，结合在芯片玻璃表面 1 μm的磁珠提供足够的信号，由连接酶介导退火反应，引物与片段的接头序列连接。每一轮反应，DNA 连接酶连接特异的荧光标记的 8mer，每一个连接步骤后被荧光检测，接着再生去除 8mer 上的碱基（包括荧光基团）同时准备延伸反应，进行下一轮连接反应。每个碱基通过两个独立的探针匹配两次，被测序两次，通过连接在 8mer 上的荧光基团可识别两碱基组合，所以将各个读长和已知的高质量参考序列比对，可筛选出序列。测序错误的情况是两个独立探针在同一个位置碱基均读取错误并且读出错误的碱基也一致的组合概率，因此保障了测序的准确性[8]。

测序反应,编码原理,心脏传导系统

图2. SOLiD 测序仪连接测序反应及双碱基编码原理[8]Figure 2. The ligase-mediated sequencing approach and principles of two-base encoding of theSOLiD sequencer[8]1.3 钠离子通道与遗传性心律失常心脏传导系统控制心脏有节律地收缩和舒张，将血液泵送至全身。心脏传导系统包括：窦房结（sino-atrial node，SAN）、结间束、房室结(atrioventricular node，AV)、希氏束和浦肯野纤维（His-Purkinje）系统。SAN 于 1907 年发现，其中含有特化的 P细胞，生理条件下是心脏的起搏点，控制心率，引起动作电位，使兴奋在心脏中传导[12]。AV 中含有慢传导细胞，在心房和心室收缩之间产生延迟。His-Purkinje 中可进行快速传导保障心室细胞同步收缩。心肌细胞具有自律性、兴奋性和传导性这 3 个特点，这是由细胞膜电位特征决定的[13]。心肌细胞的钠离子、钙离子、钾离子对于心肌细胞膜电位重要，心肌细胞动作电位需要各种离子通道的有序配合，通道顺序开放并保持动态平衡是心脏正常

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[14]。图3. 心脏离子通道在心肌动作电位（AP）中的作用示意图[13]Figure 3. A schematic representation of the cardiac action potential (AP)[13]自 1995 年，Wang 等首次将离子通道基因 SCN5A 突变和家族性遗传性心律失常——长 QT 综合征（LQT syndrome 3，LQT3）关联起来[15]，开启了离子通道相关基因在遗传性心律失常研究的大门。随后其带领的科研团队对有原发性心室纤维颤动（IVF）病史的家系成员进行遗传连锁分析，发现 SCN5A 基因变异的错义突变和移码突变，影响钠离子通道的激活和失活[16]。SCN5A 基因编码心脏电压门控钠离子通道 α 亚基 Nav1.5，定位于 3p21。SCN5A基因全长 80 kb，包含 28 个外显子。除 LQT3、IVF 外

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