花生应答果腐病病原菌侵染的转录组和miRNAs研究及抗性相关基因克隆

发布时间：2020-08-26 17:05

【摘要】：花生果腐病是花生生产上的一种主要病害,对花生的产量和品质构成了严重的威胁。近年来此病在我国北方产区有连年加重之势。目前对花生果腐病的研究主要集中于对已知病原菌的分类和鉴定上,对于近几年果腐病多发的山东莱西地区的致病真菌的分离与鉴定却少有报道,有关花生响应果腐病的机理研究也鲜有报道。本研究以花生果腐病根际土壤和感病花生为材料,利用454 FLX+测序技术分离了莱西地区果腐病病原真菌;以感病前后的花生籽仁为样品,利用转录组和miRNA测序技术构建了花生响应果腐病相关基因和miRNA的表达变化图谱,并且筛选了关键基因AhMAKK4进行基因克隆和抗性分析等研究。通过这些研究,可以有目的性的分离病原真菌,克隆花生响应果腐病过程的关键基因及miRNA,为利用基因工程改良花生抗病性提供病原材料和理论基础。本研究取得主要结果如下:(1)利用454 FLX+测序技术分离了莱西地区花生果腐病土壤中的病原真菌。测序得到真菌ITS序列46,723条,注释得到1,706个OTUs(Operational Taxonomic Units),其中对照样品OTUs共计1206个,果腐病样品中OTUs共计974个,对照样品和果腐病样品中共有的OTUs数量是474个。真菌OTUs可以分类到6个门,24个纲,272个属。分类到种的水平上,物种丰度最高的真菌是Fusarium sp.OreYA。RDA(Redundancy analysis)分析发现花生品种、环境因子和病原真菌之间存在密切的相关性。这些分析表明,花生感染果腐病之后土壤真菌数量下降,而且其结构变化趋势受到土壤环境因子和花生品种的共同影响,且在莱西地区果腐病病原真菌以镰孢菌为主。从花生果腐病土壤中分离出4种未知真菌,从感病花生上分离到1种镰孢菌。花生幼苗和离体组织接种该镰孢菌发现,幼苗活体和离体组织均被其侵染并发病,这表明该镰孢菌可能是花生果腐病的致病真菌。(2)利用转录组测序得到花生响应果腐病相关的基因表达变化图谱。转录组测序共计得到Unigene 60,756个,其中差异表达基因共计14,482个,表达量上调的基因10,147,下调的基因4,334个。qRT-PCR检测了21个基因的表达变化趋势,其结果和转录组测序结果一致。GO富集分析差异表达基因被分类到24种细胞组分,5种分子功能和23种生物过程中。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析发现有4,291个差异基因被注释到34条代谢通路中,其中70个差异表达基因参与多种植物激素信号转导途径,50个差异表达基因参与植物-病原菌互作途径,17个差异表达基因参与MAPK信号转导途径。这些分析表明在花生响应果腐病过程中存在大量差异表达基因,推测其抗病过程是多基因共同作用的结果。(3)筛选得到花生响应果腐病相关的激素信号转导途径和关键基因。在水杨酸介导的抗病途径中,2个NPR1基因在果腐病样品中表达量下调;5个TGA基因在果腐病样品中表达量下调,而PR基因在两样品中表达量没有明显变化。在茉莉酸介导的抗病途径中,2个JAR1基因在对照样品中表达量上调,而JAZ在果腐病样品中表达量下调。在乙烯介导的抗病途径中,1个ETR基因在对照样品中表达量上调,而2个EIN3和1个EBF1-2基因在对照样品中表达量下调。这说明果腐病病原菌入侵花生时,可能是茉莉酸的含量上升降解了JAZ促使下游的转录因子EIN3和EBF1-2等的表达起始转录。在生长素介导的信号途径中,3个GH3基因在果腐病样品中表达量上调,6个IAA基因在对照样品中表达量上调。这说明花生响应果腐病与内源激素变化有很大关系,通过分析关键基因的表达变化图谱,推测花生可能通过JA/ET介导的抗病途径来抵抗果腐病病原菌的侵染。(4)利用小RNA测序分析得到花生响应果腐病过程中miRNAs的表达变化图谱。miRNA测序共获得了334个miRNAs,其中有97个miRNAs在果腐病胁迫后表达量下调,27个miRNAs在果腐病胁迫后表达量上调。qRT-PCR检测了15条miRNA的表达趋势,绝大多数的miRNA表达趋势与sRNA测序结果一致,这表明miRNA测序结果的准确性较高。对mi RNAs做靶基因预测,有303个miRNAs预测到1,998个靶基因和2,646个靶标位点。119个差异表达miRNA预测到152个靶基因。这说明,在花生响应果腐病的过程中产生不同的miRNA,其表达趋势也不同,而且同一个miRNA可以靶标多个基因,可能存在多个靶标位点。(5)转录组和miRNA测序的关联分析。结果发现受10个miRNA所调控的14个基因在转录组测序结果中均可以检测到。同时还检测到4个miRNA和其靶基因间存在负调控关系。这说明miRNA通过负调控靶基因参与花生响应果腐病的分子调控过程。(6)筛选出抗病关键基因AhMKK4,进行基因克隆和表达分析研究。克隆得到AhMKK4基因,其序列全长1,434bp,含有3'非编码区151bp,5'非编码区317bp,开放阅读框全长966bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。qRT-PCR分析发现该基因在根中表达量高于其他组织,具有组织表达特异性,受JA诱导时表达量上调,受SA诱导时表达量下调。这结果推测该基因可能在花生根中参与到JA介导的抗病过程。(7)花生AhMKK4基因的转基因功能研究。将AhMKK4构建在正义植物表达载体上,转入拟南芥,经筛选验证后,获得AhMKK4超表达转基因拟南芥。继代培养转基因拟南芥到T_2,进行非生物胁迫下的抗性分析。获得转基因拟南芥,在非生物胁迫下的抗性分析发现,转基因植株不具备盐、渗透等抗性,在ABA、JA、IAA胁迫条件下,根生长受到抑制。这将为下一步花生中基因功能验证提供理论基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S435.652
【图文】：

维恩图,果腐病,物种群,丰富度

在果腐病 3 个样品中共有的 OTUs 共计 89 个；而 1L 和 2L 都；2L 和 3L 都含有的 OTUs 共有 130 个，1L 和 3L 都含有的 O果表明，花生感染果腐病之后土壤中真菌数量下降，而且在不真菌的变化也有所不同。中的 OTUs 覆盖度在 97%到 99%之间，样品稀释曲线分析显 6,000 个时达到峰值（图 2-2），测序饱和度很高，数据可靠。每个土壤样品的真菌组成都很丰富，均匀程度很高。进一步对样性分析：群落丰富度指数 Chao1（59.82-72.84%）和 ACE（4样品的物种群落丰富度不同；群落多样性指数 Shannon 和 Simp的土壤样品中，物种多样性明显降低，而且在花生品种 2 中，最高，而果腐病样品物种群落丰富度最低（表 2-2）。这些结果物种群落丰富度差异。

土壤样品,曲线显示,测序,强度

图 2-2 6 个土壤样品的稀释曲线显示测序强度与 OTUs 的数量关系分析C：是对照样品，L：是果腐病样品；1、2、3：3 个花生品种。arefaction curves showing the relationship between sampling intensity and the number of recovered opertaxonomic units (OTUs) from soil of a peanut pod rot field at harvest timeC: the control sample; L: the pod rot sample. 1, 2, 3: the three cultivars.表 2-2 样品 454 FLX+测序的序列信息及 OTUs 的丰度及多样性分析 Information of sequences obtained and OTUs richness and diversity index for 454 FLX+ pyrosequencingsoil samplesOTU，操作分类单元；a 利用 mothur 软件，基于标准化的序列的 3%遗传水平进行计算。1C 1L 2C 2L 3C 3LNo.ofhighqualitysequences8992 8800 8504 6525 7575 6327OTUscoverage（%）99 98 97 97 97 97ObservedOTUsa506 297 649 478 585 505Chao1766 425 891 799 847 805ACE869 497 889 1008 987 909Shannona4 3.85 5.05 3.58 4.53 4.48Simpsona0.08 0.05 0.02 0.11 0.04 0.03

莱西市,真菌,分类结构,果腐病

山东农业大学博士学位论文（Zygomycota），约占总序列数的 3.34%；525 个 OTUs 并没有分类到任未知真菌序列，约占总序列数的 30.77%。另外，16 个 OTUs 分类到寄他动物身上的后鞭毛真核生物（Ichtyosporea）；剩余的95个OTUs在Ge同源序列。菌类群在花生的 3 个品种的 6 个样品中分类和数量明显不同。将每个样绘制成柱状图，如图 2-3 所示：与对照样品相比，子囊菌门和担子菌门，而未知真菌的数量显著下降；在品种 2 中，相比对照，果腐病土壤样量明显下降；接合菌门的数量在果腐病样品 1 中上升，而在果腐病样品在 NCBI 上没有同源序列的 95 个 OTUs 数量在果腐病样品 1 和 3 中上升品 2 中明显下降。这些结果表明，真菌组成结构存在很大的样品间差异

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