双阴性T细胞治疗髓细胞白血病异基因造血干细胞移植后复发的初步研究

发布时间：2020-08-27 18:51

【摘要】：目的:通过体外杀伤实验确定双阴T细胞对于髓系肿瘤细胞的杀伤作用,并检测双阴T细胞表面NKG2D受体以及白血病细胞表面NKG2D配体的表达,比较不同表达水平细胞的杀伤效率。对于输注双阴T细胞后患者的外周血进行定期流式检测,观察双阴T细胞在患者体内的变化。方法:本研究分为两个部分:一、体外培养及杀伤实验:从正常人外周血中提取并扩增双阴T细胞以流式细胞学检测其纯度,培养完成后进行对于冻存的髓系肿瘤原代细胞以及细胞株的杀伤实验。二、输注安全性及体内变化:将培养完成的双阴细胞输注完成输注前准备的入组患者体内后,对其血常规、外周血找异常细胞、生化及生命体征等指标进行定期检测评估疗效以及安全性,同时检测双阴细胞及肿瘤细胞在患者外周血中的数量以及百分比变化。流式细胞学数据均采用Flowjo7.6.1软件作图并分析。服从正态分布的计量资料以均值±标准差方式表示,非正态分布资料以中位数(范围)表示。连续性计量资料使用单样本t检验或非参数检验统计分析。使用使用Graph Pad Prism 5及R 3.2.2统计软件进行统计图像及数据处理,p0.05时认为数据差异具有统计学意义。结果:一、体外培养及杀伤实验提取的单个核细胞经过去CD4及CD8处理后再行培养,双阴细胞扩增良好纯度可达90%以上,17天时细胞扩增倍数为483倍。对于细胞株:DNT对于细胞株OCI-AML3的杀伤在效靶比为4:1的时候杀伤效率为30.94±1.25%,对于411细胞株的杀伤则有50.3±1.40%,对于两种细胞株的杀伤均敏感,与对照组相比均具有统计学差异(p0.05)。对于原代细胞:DNT细胞对6例AML患者的原始细胞杀伤效果强弱不等,在4:1的效靶比状态下杀伤效率18.1(4.7-38.7)%虽然高于对照组但不具有统计学意义(p=0.069),随着效靶比的提高,杀伤效率明显提高;与对照组相比,效靶比为8:1及16:1的两组杀伤效率明显高于对照组(p=0.033,0.00)。二、输注双阴T细胞治疗安全性评估及该细胞在人体内的变化4例髓细胞白血病患者的8次DNT细胞输注疗程中仅有1例(25%)出现高热,考虑为发生了CRS,予以IL-6抗体4mg/kg后患者体温控制;其中1例输注后5天出现散在红色皮疹,血常规可见嗜酸性粒细胞增高,考虑为过敏反应,予以西替利嗪抗过敏治疗后症状消失;4例患者均没有发生a GVHD或c GVHD,也未发生肝肾功能损害或出现中枢神经症状,免疫球蛋白正常,输注过程顺利,未出现寒战、呼吸窘迫、心动过速等症状,仅1人出现轻微烦躁症状;输注后2-3周中性粒细胞及血小板、血红蛋白均恢复治疗前水平,造血功能无明显损害。DNT细胞输注患者体内后6h在外周血中检出比例极低,48h后DNT细胞数量开始增加,输注5天后数量增加速度迅速加快;第二次输注后细胞数量持续增加,第5天数量稍有下降,第7天再次开始迅速增加,而后在28天内维持一定水平。输注后外周血DNT细胞绝对值的增长在具有统计学意义(p0.05)。4例患者中有3例为血液学复发,在第一次输注DNT细胞后,原始细胞比例均获得了不同程度的下降;长期随访显示原发病复发经DNT细胞治疗后,4例患者中3例患者于DNT治疗后2月、6月、10月死于原发病,1例患者治疗至今5个月依然生存。结论:1.对于来自健康人并已使用抗体吸附法去除CD4/CD8阳性T细胞的外周血单个核细胞,使用加拿大多伦多大学Zhang L教授的专利技术(名称:扩增双阴性T国际专利号:PCT/CA2006/001870、US9,018,004;中国专利号:200680043116.7)进行培养切实可行,扩增效果良好,纯度极高;培养完成的DNT细胞对于髓系肿瘤细胞株的杀伤作用极为明显;DNT细胞对于AML患者的原始细胞杀伤效率存在差异,但总体效果良好,具有统计学意义;初步推测DNT细胞可能通过NKG2D、DNAM-1与白血病细胞表面相应的配体结合发挥杀伤作用。2.DNT细胞输注人体治疗髓系肿瘤是安全的,其没有明显的脱靶损害正常细胞组织现象,CRS发生率低,无明显相关并发症发生;其进入人体后可在体内继续增殖,在输注28天内维持一定水平;DNT细胞治疗对于髓系肿瘤的治疗还需要通过进一步研究筛选合适患者以及增加治疗剂量以提高疗效。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.7

【参考文献】