木薯单宁酸合成关键基因MeLAR、MeANR的克隆及其抗螨性功能研究

发布时间：2020-08-29 10:01

　　木薯是世界近8亿人口的主粮和重要的工业原料。朱砂叶螨是木薯四大有害生物之一,药剂防治很难。培育与利用抗虫品种是最经济、有效、简便的害虫防治途径,单宁酸是公认的具有直接抗虫作用的次生代谢物质,LAR和ANR是调控单宁酸含量最关键的两个酶,但编码关键基因MeLAR和MeANR调控单宁酸含量增强作物抗虫性的功能仍缺乏直接分子证据。因此,本研究在比较分析朱砂叶螨为害前后抗螨品种C1115和感螨品种BRA900不同叶组织中单宁酸含量、LAR、ANR活性及MeLAR、MeANR表达水平差异基础上,系统开展MeLAR、MeANR克隆及其抗螨性功能研究。主要研究结果如下:1.发现单宁酸含量与木薯抗螨性显著正相关,初步证明单宁酸在木薯抗螨中的作用及其含量显著降低是朱砂叶螨趋向于为害木薯中下部叶片的重要原因之一。朱砂叶螨为害抗螨品种C1115未展开叶、展开幼嫩叶、顶芽下第三叶、中下部叶片单宁酸含量分别较受害前提高超过2倍,均显著高于感螨品种BRA900水平。朱砂叶螨为害BRA900后,除了为害8d的中下部叶片单宁酸含量显著降低外,其它不同部位叶片的单宁酸含量在螨害前后均无显著差异。2.发现LAR和ANR酶活性与木薯抗螨性显著正相关,初步证明这两个酶在木薯抗螨中的作用及其活性显著降低是朱砂叶螨趋向于为害木薯中下部叶片的重要原因之一。朱砂叶螨为害C1115未展开叶、展开幼嫩叶、顶芽下第三叶、中下部叶片的LAR和ANR酶分别较受害前提高大约2倍,均显著高于感螨品种BRA900酶活。朱砂叶螨为害BRA900后,除了为害8d的中下部叶片LAR和ANR酶活性显著降低外,其它不同发育阶段的叶片LAR和ANR酶活性在螨害前后均无显著差异。3.发现MeLAR和MeANR表达量与木薯抗螨性显著正相关,初步证明这两个基因在木薯抗螨中的功能,以及其表达量显著降低导致LAR、ANR酶活性显著降低是朱砂叶螨趋向于为害木薯中下部叶片的重要原因之一。朱砂叶螨为害C1115未展开叶、展开幼嫩叶、顶芽下第三叶、中下部叶片的MeLAR基因表达量分别较受害前提高大约2倍,均显著高于BRA900的表达水平。朱砂叶螨为害BRA900后,除了为害8 d的中下部叶片MeLAR和MeANR表达量显著降低外,其它不同部位叶片达量在螨害前后均无显著差异。4.克隆了MeLA 和MeANR基因,获得具有抗螨功能的转MeLAR和MeANR基因株系,为深度挖掘和创新利用MeLAR和MeANR基因提供理论依据。室内抗螨性结果表明,朱砂叶螨为害后,转基因株系和C1115的MeLAR和MeANR基因表达水平、LAR和ANR酶活性、单宁酸含量均显著提高,朱砂叶螨的Fo代存活率显著降低,叶片未表现出明显的螨害症状,表现出与抗螨品种C1115相似的抗螨性。而非转基因TMS60444(WT)及BRA900的MeLAR和MeANR表达水平、LAR和ANR酶活、单宁酸含量分别较为害前显著降低。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S533
【部分图文】：

结构图,载体,登录号,结构图

登录号邋ＸＰ＿０１５５７４２０８．１）邋；邋ＴＣ：可可（Ｇｅｎｅ邋Ｂａｎｋ邋登录号邋ＡＤＤ５１３５３．１）逡逑ＣＳ：邋Ｃａｍｅｌｌｉａ邋ｓｉｎｅｎｓｉｓ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＤＺ５８１６８．１）邋；邋ＤＫ：邋Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ邋ｋａｋｉ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋＮＯ逡逑ＢＡＦ５６６５４．１邋）邋；邋ＶＳ邋Ｖｉｔｉｓ邋ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉｉ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＮＰ＿００１２６７８８５．１邋）邋；邋ＬＣ邋：邋Ｌｏｔｕｓ逡逑ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＢＣ７１３３５．１邋）邋ｊ邋ＭＤ：邋Ｍａｌｕｓ邋ｄｏｍｅｓｔｉｃａ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ逡逑ＮＰ＿００１２８０９３０．１）邋；邋ＭＴ：邋Ｍｅｄｉｃａｇｏ邋ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＡＮ７７７３５．１邋）邋；邋ＰＩＴ：邋Ｐｉｎｕｓ逡逑ｔａｅｄａ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＣＡＩ５６３２１．１邋）逦；邋ＰＨＣ：邋Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ邋ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ逡逑ＣＡＤ９１９０９．１）邋；邋ＧＡ：邋Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ邋ａｒｂｏｒｅｕｎｉ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＮＰ邋００１３１６９３７．１）邋；邋ＰＹＣ：邋Ｐｙｒｕｓ逡逑ｃｏｍｍｕｎｉｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＡＧＬ８１３５２．１邋）邋；邋ＲＣ邋：邋Ｒｉｃｉｎｕｓ邋ｃｏｍｍｕｎｉｓ邋（邋ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ逡逑ＸＰ＿０１５５７４２０８．１）邋；邋ＴＣ：邋Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ邋ｃａｃａｏ邋（ＧｅｎｅＢａｎｋ邋ＮＯ邋ＸＰ＿００２５２４４０４．２）逡逑３．５基因表达载体的构建逡逑将己扩增得到的ＭｅＵ／？和ＭｄＡＷ基因片段及ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１

载体,重组子,反应体系,质粒

３．５基因表达载体的构建逡逑将己扩增得到的ＭｅＵ／？和ＭｄＡＷ基因片段及ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１邋（图２７）用Ｘｂａｌ逡逑和ＢａｍＨＩ双酶切后分别连接形成新的重组子ｐＣ－３５Ｓ－Ｍｅｉ＾ｉ？（图２８）和ｐＣ－邋３５Ｓ－逡逑ＭｅＡＷ？（图邋２９）。进一步以重组子邋ｐＣ－３５Ｓ－ＭｅＵ／？和邋ｐＣ－邋３５Ｓ－Ｍ＾Ｍ？质粒邋ＤＮＡ邋为逡逑模板，用２．２．８的引物和２．２．５（４）的反应体系及程序进行ＰＣＲ扩增，分别获得与目的逡逑基因大小一致的基因片段（图３０

载体,启动子,抗螨性,单宁酸

逦木薯单宁酸合成关键基因ＭｅｌＡ？、的克隆及其抗螨性功能研宄逦逡逑ＢａｍＨＩ逦ｘｂａＩ逡逑—｜—：：：丨邋ＨＹＧ逦ＭｅＬＡＲ逦ｕｉｄＡ逦—＇邋—逡逑ＬＢ逦Ｔ逦Ｔ逦Ｔ逦ＲＢ逡逑１邋ｎｏｓ逦１逦ｕｏ＿ｓ逦ｉ逦ｎｏｓ逡逑图２８二元载体ｐＣ－３５Ｓ－ＭｄＡＲ部分结构图。ＭＣＳ：多克隆位点；Ｐ３５Ｓ：邋３５Ｓ启动子；逡逑Ｔ３５Ｓ：邋ＣａＭＶ３５Ｓ启动子；ＴＮＯＳ：邋ＣａＭＶ３５Ｓ终止子；ＬＢ和ＲＢ分别指Ｔ－ＤＮＡ左右边界；逡逑ＨＹＧ：潮霉素抗性基因。逡逑Ｆｉｇ．邋２８邋Ｂｉｎａｒｙ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｐＣ－３５Ｓ－ＭｅＬＡＲ邋ｐａｒｔｉａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ．邋ＭＣＳ：邋Ｍｕｌｔｉｐｌｅ邋ｃｌｏｎｉｎｇ逡逑ｓｉｔｅｓ；邋Ｐ３５Ｓ：邋３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ；邋Ｔ３５Ｓ：邋ＣａＭＶ邋３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ；邋Ｔｎｏｓ邋：邋ＣａＭＶ邋３５Ｓ邋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ；ＬＢ邋ｌｅｆｔ逡逑ｂｏｒｄｅｒ；邋ＲＢ，ｒｉｇｈｔ邋ｂｏｒｄｅｒ邋ｏｆ邋Ｔ－ＤＮＡ；邋ＨＹＧ：邋ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ逡逑

【参考文献】