启动子串联及关键基因过表达对异源表达菌株中埃博霉素产量影响研究

发布时间：2020-08-31 13:30

　　 粘细菌是具有卓越次级代谢产物合成能力的革兰氏阴性细菌,被认为是开发合成新药物重要来源。纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于堆囊菌亚目,它可以将自然界中的纤维素作为碳源来满足自身的生长需求。由于其可以产生多种具有生物活性的次级代谢产物,因此纤维堆囊菌成为药用微生物的研究热点,其中埃博霉素就是由纤维堆囊菌产生的一种具有抗肿瘤活性且具有细胞毒性的大环内酯类化合物,与紫杉醇具有相似的抗肿瘤机制。但纤维堆囊菌本身代时长、遗传背景不清晰、操作手段不成熟,不利于进一步的基因改造。黄色粘球菌与纤维堆囊菌具有相似的遗传背景且基因操作手段比较成熟,因此,将次级代谢基因簇进行异源表达成为解决这些问题更佳的方法。本实验室前期将埃博霉素基因簇及其上下游序列随机插入到在黄色粘球菌Mxanthus DZ2中,得到的异源表达ZE系列菌株,但获得的最高产量仅为1mg/L,与本源菌相差甚远无法满足工业生产需要。因此,本论文尝试采用基因工程的方法对异源表达菌株进行改造。截至目前,埃坡霉素启动子改造的报道较少,对于如何选择和设计有效的启动子以改善埃博霉素生产的研究仍然缺乏。首先,根据实验室前期对埃博霉素基因簇启动子进行的预测及解析结果,构建了 1-3个核心区(EP及SP)启动子簇,并以GFP为报告基因检测了启动子簇活性,分析比较了不同启动子核心区串联个数对启动子活性的影响。结果显示,随着启动子串联个数的增加,无论是EP启动子簇还是SP启动子簇,其活性均呈现上升趋势。之后将上述构建的启动子簇插入到异源表达菌株ZE9、ZE10及KE17中的埃博霉素基因簇前端,在原始启动子上进行串联重复,以检测该方法对黄色粘球菌异源表达菌株中埃博霉素产生的影响。其中9-1SP、9-1EP和10-3SP三株菌的埃博霉素产量分别增加了 13%、72%和113%。其中以10-3SP产量最高,高达20 mg/L 左右。此外,底物供应也可能是限制埃博霉素生物合成的关键点。通过过表达酯酰辅酶A合成酶基因(ACS)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMs),除菌株状态发生变化的10-3SP-19-ACS外,过表达菌株中埃博霉素产量与对应过表达酶含量发生了同步上升,因此可以初步判断ACS和SAMs对埃博霉素的生物合成可能起到积极促进作用,过表达该基因会提高埃博霉素的产量。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;Q936
【部分图文】：

图１－２黄色粘球菌Ａ运动与Ｓ运动示意图［８］逡逑

图１－３四类粘细菌的己知次级代谢产物［１３］逡逑

图.脚曰.引匕口目目加.脚目.目图lfi埃博霉素合成基因

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本文编号：2808867