胰腺癌患者外周血胰蛋白酶原基因突变筛查及功能初步研究

发布时间：2020-09-08 09:48

　　目的:胰腺癌的发病机制相当复杂,预后极差。遗憾的是,至今尚未明确胰腺癌发生、增殖及转移的具体机制。胰蛋白酶原基因(Protease Serine 1,PRSS1),突变可以引发慢性胰腺炎,并且先前研究在胰腺癌患者的外周血中也发现存在PRSS1突变,但迄今尚未解答PRSS1突变是否是胰腺癌的原发因素。因此,本研究将通过直接测序法检测胰腺癌患者的外周血中PRSS1突变的频率,构建人源突变型胰蛋白酶原基因(PRSS1_p.Thr137Met)敲入小鼠模型(transgenic mice,mt PRSS1),验证突变型胰蛋白酶与胰腺癌之间的关系,并探索其可能的发病机制。方法:(1)抽提80例胰腺导管癌患者与220例正常对照的全血DNA,PCR扩增之后,直接测序分析,对突变与多态性位点进行定位并分析突变类型;(2)免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)分析PRSS1突变的胰腺癌组织;(3)利用转基因技术获得人源突变型基因敲入(mt PRSS1)小鼠,繁殖扩群,子代小鼠基因型鉴定;(4)mt PRSS1小鼠与野生型(Wild type,WT)小鼠用血生化检测、组织HE染色、免疫组化、免疫荧光、胶原染色和网纤染色分析小鼠的表型差异;(5)选取同窝8周龄3只mt PRSS1小鼠和3只WT小鼠,取其胰腺组织抽提RNA做q RT-PCR和Western blot对可能的通路蛋白进行验证。结果:(1)在胰腺癌患者中,发现4例携带PRSS1_p.Thr137Met突变、1例携带PRSS1_p.Gln56*突变(为新发现的突变形式,终止密码提前出现,产生截断蛋白)、1例携带PRSS1_p.Asp162Asp突变,而这些变异形式均未发现于220例正常对照中。(2)免疫组织化学显示,胰腺癌组织胰蛋白酶表达显著高于癌旁组织;(3)人源突变型PRSS1基因敲入小鼠模型(mt PRSS1)成功构建,子代(F1~F6)小鼠生长发育状况良好;子代小鼠可鉴定出突变型和野生型两种基因型,且比例符合孟德尔定律。(4)mt PRSS1小鼠血脂肪酶(lipase,LIPA)(mt PRSS1:441±69.376 U/L;WT:260±8U/L;P=0.0109)、淀粉酶(amylase,AMY)(mt PRSS1:1953.333±298.719U/L;WT:1073.333±16.073 U/L;P=0.0073)及血糖(mt PRSS1:15.433±1.464 mmol/L;WT:4.933±0.757 mmol/L;P=0.0004)明显高于正常小鼠水平。(5)组织病理显示mt PRSS1小鼠相对于同一窝野生型小鼠出现胰腺小导管结构和细胞的异型性,导管上皮细胞排列紊乱、粘液化生,上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia,Pan IN)。(6)Western blot结果发现mt PRSS1小鼠的DNA损伤诱导转录本(DNA Damage Inducible Transcript,DDIT4)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3,PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)、基质金属蛋白酶(Matrix Metallopeptidase,MMP)(MMP1,MMP8和MMP9)表达均高于WT小鼠,抑癌基因(Tumor Protein p53,p53)表达低于WT小鼠。(7)q RT-PCR分析表明,mt PRSS1小鼠胰腺组织中信号传导及转录激活因子(Signal transducers and activators of transcription,STAT)(STAT5A和STAT6)、酪氨酸蛋白激酶(Janus Kinase,JAK)(JAK1和JAK2)表达量均升高。结论:(1)胰腺癌患者的外周血中存在PRSS1基因突变,其中PRSS1_p.Thr137Met为相对高频突变(5%)。(2)mt PRSS1小鼠与人类胰腺癌早期改变存在着相似的变化,PRSS1_p.Thr137Met突变可引发胰腺一些胰腺损伤、炎症和肿瘤指标的改变。(3)PRSS1_p.Thr137Met突变导致DDIT4高表达,还可能同时激活PI3K-Akt与JAK-STAT两条信号通路导致胰腺癌的发生,通过MMPs发生侵袭与转移。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.9
【部分图文】：

PCR扩增反应,条件,测序,胰腺肿瘤

图 1.1 PRSS1 基因的 PCR 扩增反应条件PCR 进行 35 次循环获得 PCR 产物，-20℃保存。.7.5 PCR 产物纯化及测序吸取PCR产物20μl直接送铂尚生物技术（上海）有限公司纯化及测序，并结果在NCBI上与标准序列（NCBI Reference Sequence: NG_008307.3）进行对，确认突变的存在。结果.1 胰腺癌患者影像资料与胰腺肿瘤组织H&E染色

影像,胰腺癌,影像,患者

部分疑似胰腺癌患者影像

胰腺肿瘤,胰腺癌,胰蛋白酶原

18图1.3 部分患者胰腺肿瘤组织(H&E x200)（A）高分化腺癌；（B）中分化腺癌；（C）中-低分化腺癌；（D）低分化腺癌确诊为胰腺癌，部分患者的病理组织 HE 切片分别呈不同分化的腺癌（图1.3）。1.3.2 胰腺癌患者胰腺组织免疫组化免疫组化结果提示，在胰腺正常组织中，胰蛋白酶原表达阴性；在胰腺癌组织和癌旁组织中，表达为阳性。图1.4 胰腺癌组织中高表达胰蛋白酶原(IHC x200)（A）正常胰腺组织；（B）胰腺癌组织；（C）胰腺癌旁组织1.3.3 PRSS1 基因相对应的引物 PCR 扩增结果（图 1.5）PCR 产物条带清晰，但较预计目标产物位置稍显滞后，是否与染料结合之后影响分子量有关？我们将 PCR 产物直接送往铂尚生物技术（上海）有限公司测序，将测序结果与 NCBI 标准序列比对进一步验证。

【参考文献】