甘蓝型油菜自交不亲和反应候选基因的功能研究及挖掘

发布时间：2020-09-08 19:49

　　自交不亲和反应是高等植物进化出的一种阻止自花授粉、促进异花授粉的繁殖机制,有利于防止自交衰退,在育种及遗传上具有重要的研究价值。近年,甘蓝型油菜自交不亲和反应分子机制的研究取得了较大突破,然而其下游信号传导因子的鉴定仍非常有限。本研究以甘蓝型油菜Westar及拟南芥Col-0生态型为材料,利用序列分析、遗传转化、表达分析、酵母双杂交、转录组测序等手段,通过对亲和及不亲和反应信号传导途径的研究,成功鉴定甘蓝型油菜自交不亲和反应正调控因子Bn CIMS1(Cobalamin-Independent Methionine Synthase 1),为自交不亲和反应分子机制的研究提供了新的思路;同时证明了At CIMS1在拟南芥自交不亲和反应中具有保守功能,为探索拟南芥属植物与芸薹属植物间自交不亲和系统的保守性提供新的证据。取得结果如下:1.Bn CIMS1在甘蓝型油菜自交不亲和反应中的作用经共线性和进化树分析,发现CIMS1及其同源基因CIMS2的基因组序列和蛋白序列在十字花科物种中都是高度保守的。时空表达分析发现,Bn CIMS1在甘蓝型油菜Westar柱头和茎的表达量最高,在其它部位表达量相对较低。Bn CIMS2在Westar各部位中表达量极低,在柱头中几乎不表达。在甘蓝型油菜Westar柱头中通过RNAi技术下调Bn CIMS1的表达,可部分打破甘蓝型油菜的自交不亲和性,说明Bn CIMS1是自交不亲和反应的正调控因子。亚细胞定位结果显示Bn CIMS1主要在胞质中表达。通过酵母双杂交技术验证Bn CIMS1与自交不亲和反应相关基因Bn SRK-1及Bn ARC1间的相互作用关系,发现Bn CIMS1与两个基因间均无互作关系,说明Bn CIMS1以一种新的未知途径调控自交不亲和反应。2.转基因自交不亲和拟南芥的创建及CIMS1功能保守性分析将自交不亲和A.halleri最显性的S13单倍型Ah SRK13和Ah SCR13以及自交不亲和相关基因Ah ARC1共同转入拟南芥Col-0生态型中,成功得到部分转基因自交不亲和拟南芥,而只转入Ah SRK13和Ah SCR13的转基因株系全部表现为自交亲和。说明ARC1确实为自交不亲和反应所必须。为验证At CIMS1和At CIMS2在拟南芥自交不亲和反应中是否具有保守功能,分别构建了转基因自交不亲和拟南芥与cims1、cims2 T-DNA插入突变体的杂种F1,筛选纯合突变体背景的F2转基因株系,各单株均为自交亲和,证明At CIMS1和At CIMS2都在维持拟南芥自交不亲和反应中起作用,且CIMS1在甘蓝型油菜和拟南芥自交不亲和反应调控中具有保守功能。3.BC等其它自交不亲和反应候选基因的功能研究⑴BC的下调导致甘蓝型油菜和拟南芥叶片发育异常分别在甘蓝型油菜Westar和拟南芥Col-0中下调BC(Biotin carboxylase)的表达,发现转基因Bn BC RNAi Westar株系和At BC RNAi Col-0株系叶片发育异常,主要表现为叶片皱缩,且转基因At BC RNAi Col-0株系柱头对花粉粘附力下降。⑵SLR1启动子的特异性分析克隆甘蓝型油菜Westar SLR1基因启动子,并连接GUS报告基因,转入拟南芥Col-0中。通过GUS染色分析SLR1启动子特异性,发现SLR1启动子在开花当天的雌蕊柱头特异表达,同时在幼苗期除子叶外其它部位及成熟叶片中均有表达。证明SLR1启动子在拟南芥中并非柱头特异启动子。⑶ANN1等三个候选基因的功能研究在甘蓝型油菜Westar柱头中特异下调自交不亲和反应候选基因ANN1(膜联蛋白基因)、FBA2(果糖二磷酸醛缩酶基因)以及MUR5(可逆的磷酸化多肽)的表达,发现三个基因分别被干涉后不能影响甘蓝型油菜的自交亲和性,且在转基因植株中未观察到其它表型变化。4.转录组分析亲和/不亲和反应基因表达的时相变化对甘蓝型油菜亲和及不亲和授粉后不同时间点的柱头进行转录组分析。根据差异表达基因的分布情况,将授粉事件分为早期授粉事件和晚期授粉事件,并发现自交不亲和反应信号传导路径比亲和反应更复杂。通过对差异表达基因的功能注释,提出了一些可能调控花粉-柱头互作机制的假设。根据对柱头富集表达基因的代谢途径的注释,发现SAM循环中所有基因都在柱头中高表达,包括本文已验证的自交不亲和反应正调控因子BnCIMS1。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S565.4
【部分图文】：

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8图 1.1 芸薹属植物自交不亲和反应信号传导模式（Yamamoto and Nishio 2014）(A) 芸薹属自交不亲和反应 SRK-ARC1-Exo70A1 信号传导途径。(B) 自交不亲和反应 SRK-ARC1-GLO1 信号传导途径。Fig. 1.1 Models of the identified self-incompatibility signaling pathways in Brassica (Yamamoto and Nishio 2014)(A) The self-incompatibility signaling pathway mediated by SRK-ARC1-Exo70A1 in Brassica. (B) Tself-incompatibility signaling pathway mediated by SRK-ARC1-GLO1.

示意图,十字花科,过程,柱头乳突细胞

柱头乳突细胞结构研究发现，授粉后白菜柱头乳突细胞内的肌动蛋白构成的细胞骨架会发生变化（图1.2）（Iwano et al 2007）。给白菜授以亲和花粉，或者用亲和花粉外被处理柱头时，引发柱头乳突细胞顶端肌动蛋白聚合现象，致使花粉水合过程中顶端区域肌动蛋白束增加。这一发现刚好解释了分泌囊泡沿肌动蛋白骨架向柱头与花粉接触位点运输，促进囊泡的聚集和膜融合（He and Guo, 2009）。在授亲和花粉的柱头乳突细胞内可观察到大型中心液泡和管状液泡向花粉接触点移动，推测这一现象是将花粉水合所需的水分及物质运送到花粉细胞。而对白菜柱头授不亲和花粉或以不亲和外被提取物处理时，柱头乳突细胞顶端微丝数量减少，且管状液泡呈现不规则排列（Iwano etal 2007）。

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图 1.3 三系法生产甘蓝型油菜自交不亲和杂种模式图（傅廷栋 19 production modle of triple-cross hybrid using B. napus self-incompTingdong 1995)jana and Nasrallah（2015）将 SRK 及其对应 S 单倍型的 SCR胞中共表达，理论上可以实现自交不亲和反应在柱头细胞柱头乳突细胞中表达的 SCR/SP11 并不能像来源于花粉外壁K 介导的自交不亲和反应，相反地，却抑制了 SRK 的活性表达的 SCR/SP11 与其受体 SRK 在柱头乳突细胞内相互作中，而不能转移到柱头乳突细胞膜上，阻碍了 SRK 的跨膜CR/SP11 的互作，因而不能产生自交不亲和反应信号，阻递。这一现象类似于在多细胞动物中发现的将跨膜蛋白作径，被叫做配体介导的顺式抑制作用（ligand-mediated

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