双基因共表达策略对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用研究
发布时间:2020-09-12 13:07
二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)是一种ω-3系列长链多不饱和脂肪酸,具有抗凝血、预防心血管疾病、降血脂等特殊生理功能,在保健品、食品和饲料行业均有较多的应用。产油微生物高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)已用于工业化生产花生四烯酸(Arachidonic acid,AA),其AA产量约占总脂肪酸的50%,常温条件下不产EPA,低温条件下EPA产量仅占总脂肪酸含量的2%左右。ω-3脂肪酸脱饱和酶具有催化AA生成EPA的作用,是ω-3长链多不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶。本实验室前期成功将来源于寄生疫霉的脂肪酸脱饱和酶oPpFADS17在高山被孢霉中进行表达,重组菌中EPA含量显著提高。而还原力NADPH在脂肪酸合成过程中起关键作用,实验室前期成功将产生还原力的关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2在高山被孢霉中进行了表达,重组菌中总脂肪酸含量得到提升。本文为了同步提高高山被孢霉中总脂含量和EPA含量,尝试应用双表达盒策略和2A肽策略在高山被孢霉中同时表达ω-3脂肪酸脱饱和酶oPpFADS17基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2基因,分析两种基因对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用。本课题主要结果如下:1.双表达盒策略中ω-3脱饱和酶oPpFADS17和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2共表达重组菌中总脂含量提高了20%左右。通过在表达载体上引入两个表达框,高山被孢霉重组菌总脂含量比野生型高山被孢霉提高了20%左右,G6PD2基因转录水平比野生型高山被孢霉提高了3-5倍,酶活水平比野生型高山被孢霉提高2倍左右,NADPH水平比野生型高山被孢霉提高了20%左右;实验结果分析表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在高山被孢霉重组菌中成功过表达,且有效促进高山被孢霉重组菌脂质的合成。高山被孢霉重组菌中EPA含量没有达到理论预期含量,我们首先从基因转录的角度进行了分析,发现高山被孢霉重组菌中ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的转录水平比对照重组菌M.alpina-oPpFADS17降低20%左右;据此,我们推测ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因转录水平降低导致了高山被孢霉重组菌检测不到EPA含量的提高。2.2A肽策略中ω-3脱饱和酶oPpFADS17和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2共表达重组菌中EPA含量提高到占总脂含量的30.6%,AA转化为EPA的转化率达到77%。实验结果显示,与野生型高山被孢霉相比,高山被孢霉重组菌EPA产量提高到30.6%。转录水平结果显示,高山被孢霉重组菌中ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的转录水平提高了20%左右,而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2基因的转录水平与野生型高山被孢霉相当;酶活水平和NADPH水平结果显示,重组菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2的活性及其提供的还原力NADPH与野生型高山被孢霉相当。据此,2A肽策略中过表达ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2基因能够显著提高高山被孢霉重组菌中EPA含量,由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶所提供的还原力NADPH没有显著增加,造成了高山被孢霉重组菌中脂肪酸含量没有提高。
【学位单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:TS201.3
【部分图文】:
图 1-1 EPA 的结构式Fig. 1-1 Chemical structure of EPA中,亚麻籽油含有 58%的 ALA,酸脱饱和酶(Fatty acid desatura来源于植物油脂的 ω-3 多不饱和PA 经“Sprecher”途径生成 DPA后经 β-氧化脱去两个碳生成 D常低(小于 1%),EPA、DHA 3 PUFAs 大多直接来源于食物。E取,因此人们多从以富含 ω-3 PU EPA、DHA 的含量最高,如鲱HA 占总脂肪酸的 10.8%左右[18]。对海洋鱼类的过度捕捞使得海洋找新的可持续的 ω-3 PUFAs 替代 PUFAs 来源的不足,是理想的
绪 论一种高产脂质的丝状真菌,其总脂含量可以达到细胞干重的 50%左右。该菌广泛存在土壤中,营腐生生活,以分生孢子进行无性繁殖,具有接合真菌典型的无性生殖方式[2(图 1-2)。当在营养丰富的培养基上生长时,菌落形态呈白色玫瑰花瓣状,表面有棉状菌丝体,产少量乳白色孢子。显微镜下观察可以看到菌丝内部含有大量油滴,如图 1所示。高山被孢霉合成的 AA 已经通过美国食品药物管理局的安全性评估,它可以作食品级的工业产油微生物,同时也是脂质生物化学基础研究的重要模式微生物[22]。本验室已对 M.alpina ATCC32222 进行了全基因组测序及转录组信息的分析,并对其脂合成途径进行了全面解析[23]。
图 1-2 高山被孢霉生活史和菌丝显微形态Fig. 1-2 The microscopic phenotypes of M. alpina mycelia高山被孢霉合成多不饱和脂肪酸的研究进展 高山被孢霉 PUFAs 合成途径山被孢霉内多不饱和脂肪酸的合成主要由底物乙酰辅酶 A,脂肪酸合酶和通过脂肪酸进行一系列的脱饱和及碳链延长来完成的(图 1-3)。脂肪酸合产物一般是 C16:0,其他脂肪酸都以 C16:0 为前体合成而来。C16:0 经延酶合成 LA 和 ALA。LA 作为 ω-6 系列 PUFAs 的最初产物,ALA 作为 ωs 的最初产物,经 FADS6、ELO6、FADS5 的催化作用分别形成最终产物此外,ω-6 系列的脂肪酸经 ω3 脱饱和酶作用后可被转化为 ω-3 系列脂肪
本文编号:2817664
【学位单位】:江南大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:TS201.3
【部分图文】:
图 1-1 EPA 的结构式Fig. 1-1 Chemical structure of EPA中,亚麻籽油含有 58%的 ALA,酸脱饱和酶(Fatty acid desatura来源于植物油脂的 ω-3 多不饱和PA 经“Sprecher”途径生成 DPA后经 β-氧化脱去两个碳生成 D常低(小于 1%),EPA、DHA 3 PUFAs 大多直接来源于食物。E取,因此人们多从以富含 ω-3 PU EPA、DHA 的含量最高,如鲱HA 占总脂肪酸的 10.8%左右[18]。对海洋鱼类的过度捕捞使得海洋找新的可持续的 ω-3 PUFAs 替代 PUFAs 来源的不足,是理想的
绪 论一种高产脂质的丝状真菌,其总脂含量可以达到细胞干重的 50%左右。该菌广泛存在土壤中,营腐生生活,以分生孢子进行无性繁殖,具有接合真菌典型的无性生殖方式[2(图 1-2)。当在营养丰富的培养基上生长时,菌落形态呈白色玫瑰花瓣状,表面有棉状菌丝体,产少量乳白色孢子。显微镜下观察可以看到菌丝内部含有大量油滴,如图 1所示。高山被孢霉合成的 AA 已经通过美国食品药物管理局的安全性评估,它可以作食品级的工业产油微生物,同时也是脂质生物化学基础研究的重要模式微生物[22]。本验室已对 M.alpina ATCC32222 进行了全基因组测序及转录组信息的分析,并对其脂合成途径进行了全面解析[23]。
图 1-2 高山被孢霉生活史和菌丝显微形态Fig. 1-2 The microscopic phenotypes of M. alpina mycelia高山被孢霉合成多不饱和脂肪酸的研究进展 高山被孢霉 PUFAs 合成途径山被孢霉内多不饱和脂肪酸的合成主要由底物乙酰辅酶 A,脂肪酸合酶和通过脂肪酸进行一系列的脱饱和及碳链延长来完成的(图 1-3)。脂肪酸合产物一般是 C16:0,其他脂肪酸都以 C16:0 为前体合成而来。C16:0 经延酶合成 LA 和 ALA。LA 作为 ω-6 系列 PUFAs 的最初产物,ALA 作为 ωs 的最初产物,经 FADS6、ELO6、FADS5 的催化作用分别形成最终产物此外,ω-6 系列的脂肪酸经 ω3 脱饱和酶作用后可被转化为 ω-3 系列脂肪
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4 易绍金;郑义平;;产油微生物的研究及其应用[J];中外能源;2006年02期
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本文编号:2817664
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