小麦类过敏反应突变体抗病性研究及氮依赖性类过敏反应基因的定位

发布时间：2020-09-12 19:36

　　小麦类过敏反应(hypersensitive reaction-like,HRL)是一类在没有病原物侵染情况下就能自发产生类似病原菌侵染后的过敏反应症状,这类突变往往能够增强小麦的抗病能力并且提高防御相关基因的组成性表达。中国小麦品种宁7840通过自发性类过敏反应的产生介导了成株期的广谱抗病性。EMS诱导获得了宁7840的两个HRL缺失突变体:Dlm1和Dlm2,并且两个突变体都易感白粉病。通过对抽穗期的Dlm1,Dl12突变体和野生型宁7840旗叶提取RNA进行转录组测序来阐述类过敏反应产生的分子机制。结果表明,在宁7840中,二萜化合物相关的压力应激反应介导了类过敏性反应和广谱抗性的产生。此外,在DLM突变体中,氧化磷酸化、蛋白酶解体和光合途径也与抑制类过敏性反应表型相关。这在小麦中提供了一个新的了解类过敏性反应和广谱抗性的分子机制的途径。本实验对携带HRL性状的宁7840进行EMS诱变和连续选择,筛选到14个比野生型的HRL表型更为明显的突变体。同时,对这14个突变体和野生型进行四个不同氮素水平处理,结果表明:宁7840野生型在低氮条件下,能够诱导HRL性状的提早表达,随着施氮量的增加,HRL性状延迟显现并逐渐消失(non-HRL),白粉病也随之加重,表现为氮依赖型;但在高氮(每盆6g和9g尿素)条件下,有2个突变体(NMu-HRL-1和NMu-HRL-2)依旧表现HRL性状,为非氮依赖型。通过比较13个氮依赖型(包括宁7840野生型)和2个非氮依赖型的HRL突变体氮肥吸收利用情况,发现两种类型的突变体的氮肥吸收利用效率和施氮量都成负相关关系,同一氮肥水平下,非氮依赖型突变体穗部的氮含量和氮素吸收利用效率都显著高于氮依赖型突变体。低氮(每盆Og和3g尿素)条件下,非氮依赖型突变体的叶绿素含量显著低于氮依赖型突变体,高氮条件下,两种类型突变体植株内叶绿素含量差异不显著。在同一氮肥处理水平下,这两种类型的突变体之间白粉病严重度存在极显著差异,氮依赖型HRL突变体在高氮条件下白粉病严重度极显著高于非氮依赖型HRL突变体,非氮依赖型突变体在高氮条件下仍然高抗白粉病。小麦品系P7001携带的HRL性状在Og氮处理下表达,但当氮供应较多时,该性状消失,因此我们认为该表型受氮素调控,并称之为氮依赖性。我们结合BSA和RNA-seq技术(BSR-Seq),并利用P7001×P216的F5代的重组自交群体将P7001中氮依赖的HRL基因(Ndhrl1)定位在小麦2B染色体的短臂上,位于CAPS/dCAPS标记7hrC9和7hr2dc14之间,且HRL性状与dCAPS标记7hrdc2共分离。在此定位的基础上,进一步对小麦2Bs染色体的参考基因组序列的SSR位点筛查,开发并筛选到207个多态性SSR标记,应用其中3个区间内的SSR标记和共分离标记7hrdc2对F7次级分离群体的2437个单株进行基因型分析和表型鉴定,将Ndhrl1定位于分子标记7hrdc2与C075783之间,物理距离8.5 Mb。从该基因的染色体位置和性质方面来看,Ndhrl1很可能是小麦中的一个新基因。转录组测序数据的进一步分析表明,植物-病原体相互作用、氮代谢、玉米素生物合成和植物激素信号转导这四条信号路径在HRL植株和non-HRL植株间差异显著。该研究对理解小麦HRL性状的多样性及解析广谱抗性机制以及阐明氮肥、类过敏反应和抗病性之间的关系具有一定的意义。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.12
【部分图文】：

转录本,突变体,野生型,测序

为了获取三个样本间的差异表达基因，进行了标准化分析。差异表达基因分析表明，逡逑宁７８４０和Ｄ／ｗｉ，宁７８４０和Ｄ／ｍ２还有Ｄ／ｗ／和Ｄ／ｍ２的差异基因表达的个数分别为逡逑５５４６，邋３４８９和３９９５个（图２．２ａ）。其中，在宁７８４０和Ｚ）／ｍｉ／Ｄ／ｍ２中有１７３０条转录本的逡逑差异基因表达，这些转录本的表达水平在和￡＞／？２之间没有显著差异，这表宁７８４０逡逑特异的差异基因表达控制宁７８４０的ＨＲＬ表型。通过同样的方法也已经鉴定出Ｄ／ｍ７中有逡逑２７３５个特异差异基因表达，并且Ｚ）／ｍ２中有２００个特异的差异基因表达。这些转录本的差逡逑异表达可能是由于Ｄ／ｗｉ和Ｄ／ｍ２中相关基因的突变（图２．２ａ）引起的。逡逑为了验证ＲＮＡ－ｓｅｑ的结果，从ＲＮＡ－Ｓｅｑ数据中随机挑选２７个不同的转录本，通过Ｑ－逡逑ＰＣＲ验证两个对照基因（肌动蛋白和Ｇａｐｄｈ）的表达水平。为了验证每个引物的特异性，逡逑对扩增产物进行克隆和测序。结果表明：ＲＮＡ－ｓｅｑ和ｑＲＴＱ－ＰＣＲ技术的结果有很高的相关逡逑

维恩图,转录本,富集,叶绿体基质

富集（Ｐ＜０．０５）。在细胞成分中，与叶绿体相关的器官，如叶绿体基质，膜和Ｓｔｒｏｍｕｌｅ显逡逑著富集。此外，在生物进程中，宁７８４０发生了一系列的变化。在生物和非生物方面如细逡逑菌，对光，冷和激素的应激反应都是显著富集的（Ｐ邋＜０．０５，图２．３，表２．６）。逡逑表２．６宁７８４０中差异表达差异基因逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．６邋Ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ＧＯ邋ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ邋ｆｏｒ邋Ｎｉｎｇ７８４０－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ＤＥＧｓ逡逑ＤＥＧ邋数转ｉ本逡逑}0桃逦目数目逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：邋Ｎ－ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋（Ｇ０：００１６４１０）逦１２逦３５逦２．２４Ｅ－０５逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：邋ｇａｌａｃｔｉｎｏｌ－ｓｕｃｒｏｓｅ邋ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ邋ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ逡逑（Ｇ０：００４７２７４）逦’逦＂逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：邋ｓｕｃｒｏｓｅ邋ｌＦ－ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋（Ｇ０：００５０３０６）逦６逦１４逦１．７６Ｅ－０２逡逑

差异表达基因,生化合成,蛋白酶体

蛋白酶体调节颗粒和蛋白酶体核心复合物，ａ亚基复合物等五个条目在细胞成逡逑分中显著富集。生化合成类别，四个蛋白质泛素化相关的调控路径也表现出显著差异。此逡逑夕卜，十个与抗病相关的ｐａｔｈｗａｙ也表现出差异显著（Ｐ邋＜０．０５，图２．３，表２．８）逡逑在突变体中，光合作用和氧化磷酸化两条ｐａｔｈｗａｙ表现出显著差异（表２．７）。逡逑在分子功能类别中，只有与叶绿素结合相关的ｐａｔｈｗａｙ是显著富集的。叶绿体类囊体膜，逡逑光系统ＩＩ和线粒体质子转运ＡＴＰ合酶复合物，催化核心Ｆ邋（１）方面，在细胞组分中显著逡逑富集。在生化合成类别中，质膜ＡＴＰ合成以及质子运输和光合电子传递链路径表现出显著逡逑差异（Ｐ邋＜０．０５，图邋３，表邋２．９）。逡逑表２．７使用ｋｏｂａｓ２．０鉴定的具有代表性的途径逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．７邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＫＯＢＡＳ２．０逡逑样品邋ＫＥＧＧ路径逦ＫＥＧＧ编号本尸澄逡逑宁邋７８４０逦Ｄｉｔｅｉｐｅｎｏｉｄ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ逦ｋｏ００９０４逦６逦９逦１．５２Ｅ－５逡逑Ｄｌｍｌ逦Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ逦ｋｏ０３０５０逦３４逦８６逦２．１１Ｅ－９逡逑Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ逦ｋｏ００１９０逦４７逦２０２逦１．５４Ｅ－４逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｉｎ邋ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ邋ｋｏ０４１４１逦４７逦２０３逦１．７９Ｅ－４逡逑Ｄｌｍ２逦Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ逦ｋｏ００１

【相似文献】