葡萄WRKY家族基因的鉴定及VlWRKY58和VaWRKY10的功能分析

发布时间：2020-09-14 11:04

　　葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上一种重要的经济水果,制干、鲜食、酿酒、榨汁等多种用途使他给人类社会创造了极高的经济效益,但是广泛栽植的葡萄品种多为欧洲葡萄,具有极高的感病性,挖掘葡萄抗病基因,分析其抗病的分子机理,对于改善葡萄品种的抗病性具有重要的理论意义和实践价值。WRKY转录因子作为植物特有的转录调节因子,在植物的抗病调控过程中具有重要的作用。本研究依据发表的葡萄基因组数据,鉴定了葡萄中存在的WRKY家族基因,并进行了结构、进化和表达分析,初步分析了WRKY家族基因可能参与的生物调控过程,并以此为基础克隆了抗病相关的VlWRKY58和VaWRKY10,过表达遗传转化模式植物拟南芥及感病的无核白葡萄,验证了这两个基因的抗病调控功能,进而克隆了这两个基因的启动子序列,分析了上游调控元件的激活响应。取得的主要结果如下:(1)依据发表的葡萄基因组测序信息,共鉴定得到WRKY基因家族成员59个,根据他们在葡萄染色体上的位置分布,将其命名为VvWRKY1-VvWRKY59。多重序列比对显示59个VvWRKY蛋白保守结构域完整,依据VvWRKY保守结构域特征和系统发育树将59个VvWRKY分为了GroupⅠ-Ⅲ三大类,分别包含12、40和6个VvWRKY,GroupⅡ又分成了a-e五个亚组,分别包含3、8、15、7和6个VvWRKY。59个VvWRKY存在4组串联重复事件,15组隔离重复事件,并且存在66个和拟南芥AtWRKY之间的同线性事件,说明了重复事件是VvWRKY进化过程中伴随的一类主要事件。VvWRKY40和VvWRKY45在葡萄根系里表达量较高,VvWRKY42和VvWRKY52在葡萄叶片里表达量较高,这是VvWRKY组织器官特异性表达的体现。22个VvWRKY在葡萄白粉菌处理后表现出上调表达,18个VvWRKY在SA处理后表现出上调表达,14个VvWRKY在ABA处理后表现出上调表达,MeJA和ETH处理后VvWRKY的上调表达基因数量更多,干旱胁迫处理后VvWRKY上调表达也较为明显,这说明了VvWRKY与葡萄生物胁迫、非生物胁迫及植物激素信号响应确实存在密切的关系,VvWRKY58在白粉菌接种处理后上调表达明显,VvWRKY10则在MeJA和ETH处理后表现出上调表达。(2)采用RT-PCR从葡萄材料巨峰克隆得到了VlWRKY58的cDNA序列,开放阅读框为2241 bp,编码747个氨基酸。构建VlWRKY58 35S诱导的过量表达载体,转化模式植物拟南芥,转基因和野生型拟南芥植株接种白粉菌和灰霉菌,发现VlWRKY58转基因株系对白粉菌表现出明显的抗病性,单位质量叶片上的孢子数显著偏少,而对灰霉菌表现出感病性,病斑面积显著偏大,而且PR1、NPR1这两个与SA信号途径相关的基因在VlWRKY58转基因拟南芥株系里表现出显著病原菌诱导表达,而PDF1.2这个与JA信号途径相关的基因在VlWRKY58转基因拟南芥株系里病原菌的诱导表达则表现出明显的减弱,这说明VlWRKY58参与的抗病调控与SA信号途径具有一定关系;另外,VlWRKY58转基因拟南芥株系在接种细菌性病原菌Pst DC3000后表现出明显的感病性,叶片明显发黄,活性菌数量也显著偏多,PR1基因在VlWRKY58转基因拟南芥株系里Pst DC3000的诱导表达呈现下降趋势,这与接种白粉菌和灰霉菌表现不同。采用反转录PCR,从巨峰葡萄克隆得到了VlWRKY58基因-1952bp的启动子序列,构建了四个启动子缺失片段载体并瞬时转化了红地球葡萄,GUS染色分析,VlWRKY58启动子-608bp到-1034bp之间的序列存在2.1倍于对照的葡萄白粉菌诱导激活活性,这段启动子序列分布着两个TCA-element,一个TGACG-motif,一个P-box和一个TC-rich repeats,可能正是TCA-element的存在,增强了VlWRKY58的SA信号响应,从而增强了VlWRKY58参与的白粉病抗性调控。通过酵母双杂交技术筛选得到葡萄葡聚糖1,3-β葡萄糖苷酶、葡萄甘油醛3-磷酸脱氢酶、葡萄寡肽转运蛋白4等五个不同的葡萄功能蛋白,这些蛋白与VlWRKY58参与的葡萄抗病性调控可能具有一定的关系。(3)采用RT-PCR从山葡萄‘双优’克隆得到VaWRKY10的cDNA序列,开放阅读框为954 bp,编码318个氨基酸。构建了VaWRKY10 35S诱导的过量表达载体,转化了模式植物拟南芥和无核白葡萄。接种白粉菌、灰霉菌和Pst DC3000后,可以发现VaWRKY10转基因拟南芥株系对死体营养型病原菌灰霉菌表现出明显的抗病性,病斑面积显著偏小,而对活体营养型病原菌白粉菌及Pst DC3000表现出明显的感病性,白粉菌单位质量叶片上的孢子数、Pst DC3000单位面积叶片上活性菌的数量都显著增多,在接种Pst DC3000后O_2~-含量还显著降低,VaWRKY10转基因无核白葡萄接种灰霉菌后发病状况也表现出一定程度缓和,另外,LOX3和PDF1.2这两个与JA信号途径相关的基因在VaWRKY10转基因拟南芥株系里灰霉菌的诱导表达表现出显著提高,这说明VaWRKY10参与的抗病调控与JA信号途径可能具有一定关系。后续同样采用反转录PCR,从‘双优’中克隆得到了VaWRKY10基因-1597bp的启动子序列,构建了四个启动子缺失片段载体瞬时转化了红地球葡萄,GUS染色分析,VaWRKY10启动子0到-280bp之间的序列存在4.2倍于对照的MeJA诱导激活活性,这段启动子序列分布着一个TGACG-motif调控元件,可能正是该元件参与了VaWRKY10的JA信号响应,从而增强了对灰霉病的抗病性调控。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S436.631
【部分图文】：

系统进化,字模,过程,效应因子

（ETI：Effector-triggered immunity）两种途径，这两种途径的不同之式及免疫应答信号的具体增强过程（Jones and Dangl 2006）。PTI 是别受体（PRRs：Transmembrane pattern recognition receptors）识别类 PAMPs，进而激活下游的免疫调控反应；ETI 则是植物体内 R 基蛋白识别病原菌产生的特异的效应因子，进而激活的下游的免疫调控应成是建立在寄主植物与病原菌在相互作用过程中共同进化过程的基础原菌会直接或者间接的产生效应因子来产生致病性，利于自身的增殖断产生 R 蛋白，尤其是 NBS-LRR 类蛋白识别效应因子，使自身抗病原菌的互作进化过程如图 1-1。

抗性,抗病性,拟南芥,信号途径

大都含有 C-motif 这个 CaM 结合位点，与钙调蛋白的结合对 WRKY 基拟南芥基础抗病性调控也具有重要的作用（Chi et al. 2013）；另外，WRKY 转录经常存在 W-box 转录调控位点，这使得植物体内多个 WRKY 转录因子之间也经相互作用，参与调控植物的抗病过程，拟南芥 AtWRKY18、AtWRKY40 和 AtWRK个基因的突变，就会导致突变体植株对灰霉菌和 Pst DC3000 抗病性的改变，并变体、双突变体和三突变体拟南芥植株发病的表现还存在显著的差别（Xu e6）。其他物种里也有关于 WRKY 基因参与抗病性研究的报导，棉花中的 GmWRK参与灰霉病的抗性调控，这个过程与 JA 信号途径增强，SA 信号途径减弱存在关iu et al. 2016）；玉米中黄曲病的抗性也与 WRKY 基因参与的植物激素信号调控有ountain et al. 2015）；白杨 PtrWRKY73 基因的过量表达增强了转基因拟南芥植株途径相关基因 PR1, PR2 和 PAD4 的表达，对 Pst DC3000 的抗性增强起到积极的Duan et al. 2015）；大麦中 WRKY 转录因子与细菌诱导的系统获得性免疫抗性调在一定的关系（Dey et al. 2014）；ZmWRKY79 可以参与玉米体内萜类植物抗毒累，对玉米抗病性的产生具有重要作用（Fu et al. 2018）；WRKY group Ⅲ 基因卷叶病毒病也具有一定的抗性调控响应（Huang et al. 2016）。

多重序列,聚类分析,锌指结构

图 2-1 VvWRKY 蛋白的多重序列比对聚类分析 WRKY 蛋白的绝对保守结构，绿色的代表锌指结构，‘N’和‘C’分别代表 WR的 N 端及 C 端 WRKY 结构。.2-1 Multiple sequence alignment of the WRKY domain among 59 VvWRKY procate the conserved WRKY amino acid domains; green indicate the zinc-finger mots. ‘N’ and ‘C’ indicate the N-terminal and C-terminal WRKY domain of the groupproteins.25

【参考文献】