嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶基因的克

发布时间：2020-09-14 16:52

　　纤维素是植物细胞壁的主要组成部分,是地球上最丰富的可再生资源,在当前世界面临着能源危机和环境压力的情况下,如何更加有效地发挥微生物纤维素酶的作用来分解和转化自然界中储存巨大的纤维素成为能源物质,对解决资源、环境问题以及人类社会的可持续发展具有重大的现实意义,其中定点突变技术已成为人们改善纤维素酶活性的重要技术。嗜热革节孢是一种嗜热真菌,能够产生较强热稳定性和较高活力的酶,是纤维素的分解者之一。本研究意在寻找影响嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶活性的氨基酸位点,通过定点突变技术研究第十二家族糖苷水解酶催化作用机理,同时为寻找使酶活性得到提高和酶学性质得到改善的其余氨基酸位点打下基础。本研究对来自嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶基因steg1进行克隆,得到的cDNA全长为711bp,编码了237个氨基酸。将目的基因转化毕赤酵母中诱导表达并纯化蛋白,经SDS-PAGE分析,结果显示STEG1蛋白分子量大小为26kDa,与理论值27kDa大小基本一致。研究发现嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶STEG1三维结构的催化结构域是由18种氨基酸组成的一个凹槽形状的活性通道,这十八种氨基酸包括F220、P146、Y145、I144、D72、W137、W37、I147、N35、M135、V74、E133、D116、M171、N168、F118、Y77、W128。通过对STEG1结构的分析,发现纤维素酶在降解纤维素过程中会形成不同的结构,其中在与多种糖类物质反应过程中,位于活性通道上的部分氨基酸位点和葡糖基之间更易形成氢键,这些氨基酸位点更易与底物结合反应,Y145的-COOH及氨基酸主链上的N与葡糖基的-OH之间形成的氢键距离都很近。所以本研究合理选择了位于催化活性通道上的六个氨基酸位点(N35、W37、Y77、W128、Y145、N168)进行定点突变,得到了八种突变酶(N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q),经测定这八种突变酶的酶学性质各发生了不同的变化。研究结果显示,与原酶WT相比,所有突变酶的活性降低,突变酶Y77F和N35Q的热稳定性得到提高。其中突变酶Y77F、W128S、Y145A的K_m值和k_(cat)值都降低;N35Q的K_m和k_(cat)值都升高;突变酶W37H、Y145F、Y145W、N168Q的K_m值升高,k_(cat)值降低。原酶与突变酶的最适pH为5.0,均保持不变。突变酶Y77F、N35Q的最适温度降低到50℃,WT和突变酶W37H、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的最适温度为55℃。研究结果表明这六种氨基酸在第十二家族糖苷水解酶降解纤维素过程中发挥着重要的作用。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q936;Q78
【部分图文】：

图谱,废液,吸附柱,重复操作

溶液转移至 HiBind DNA Mini 吸附柱中，一次加入的量 10000rpm 离心 1min。掉废液，重复步骤（4），直到所有的样品都转移至吸附入 300μL 的 Binding Buffer（XP2），在室温条件下以 1掉废液，重复操作（6）。掉废液，加入 700μL 的 SPW Wash Buffer，在室温条件下（注意：SPW Wash Buffer 在使用前用 100%的酒精稀释。掉废液，重复操作（8）。3000rpm 空转吸附柱 2min，然后放在超净操作台 2~5min吸附柱放入干净的 1.5mL 离心管中，加入 15~30μL ddH2O3000rpm 离心 1min，测浓度。STEG1 酵母工程菌的获得

序列,内切葡聚糖酶,嗜热,三维结构模型

嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶的定点突变下分离胶，用染色液染色后用脱色液族糖苷水解酶 STEG1 突变体的真核得基酸序列提交 SWISS-MODEL 得到H12 内切葡聚糖酶的晶体结构（PD级结构的活性通道由 18 种氨基酸（Trp37、Ile147、Asn35、Met135、8、Tyr77、Trp128）组成，本研究选p37、Trp128、Tyr145、Asn168）进

序列,嗜热,内切葡聚糖酶,琼脂凝胶电泳

族糖苷水解酶 STEG1列分析行提取总 RNA，反转录得显示，嗜热革节孢第十二家成，从图 3-1 看中出片段大 WT 基因序列与 GenBank册序列为灰腐质第十二家族析可得，两段基因不同之处 C、第 464 位碱基 C、第 60、第 429 位碱基 C、第 51

【参考文献】