缺氧及NKAP基因对乳腺癌细胞学功能的调控研究

发布时间：2020-09-15 11:17

　　 第一部分:NKAP通过PI3K/AKT信号通路影响乳腺癌细胞的生物学功能目的:NKAP在转录抑制,T细胞的发育、成熟和功能获得,成体造血干细胞的维持和存活,RNA剪接等方面具有重要作用。但人们仍然相信NKAP具有很多未发现的巨大作用,尤其在癌症方面。乳腺癌是全球主要的公共卫生问题,也是妇女中最常见的癌症类型。在本文,我们想要探究NKAP与乳腺癌的发生与发展的联系。方法:通过TCGA、GTEx和GEPIA的数据库信息分析NKAP在乳腺癌患者肿瘤组织和正常乳腺组织之间的表达差异,并分析其差异表达与乳腺癌患者存活率的相关性。当发现NKAP在乳腺癌组织中显著高表达,并与预后不良相关后,我们应用RNA干扰技术敲低乳腺癌细胞MCF-7中NKAP的表达,建立NKAP敲低细胞株。随后使用CCK8实验和平板克隆形成实验探究NKAP敲低对细胞增殖和克隆形成能力的影响,通过transwell实验揭示其对细胞迁移的作用,并使用流式细胞术检测细胞凋亡情况。在机制方面,我们通过western blot寻找NKAP在乳腺癌细胞MCF-7中发挥作用的过程中涉及到的信号途径。结果:1.NKAP在乳腺癌中高表达2.NKAP敲低会抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖和克隆形成能力3.NKAP敲低会抑制MCF-7细胞的迁移能力4.NKAP敲低可以触发caspase3依赖凋亡途径,影响相关凋亡蛋白的表达,促进MCF-7细胞凋亡5.NKAP 影响 PI3K/Akt/mTOR 信号通路结论:NKAP在乳腺癌组织中显著高表达,并与乳腺癌患者的预后不良密切相关。NKAP通过AKT/mTOR信号通路在乳腺癌中发挥癌基因作用。敲低NKAP可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖和迁移,促进其凋亡。我们的研究,揭示了 NKAP在乳腺癌组织中可能具有的作用和机制;为乳腺癌的靶向治疗和预后预测提供了一定的理论数据。第二部分:NKAP在缺氧状态下对乳腺癌的影响目的:近年来,越来越多的证据表明肿瘤组织中的氧(02)含量是导致乳腺癌转移的重要决定因素。持续的肿瘤缺氧导致更多恶性肿瘤表型。在本研究中,我们将不同浓度的CoCl2与MCR-7乳腺癌细胞共同体外培养以找到最佳的低氧模型。本课题的前期实验证实了 NKAP在乳腺癌的发生和发展过程中具有癌基因的作用。在研究NKAP功能时,我们发现,乳腺癌组织内缺氧会导致NKAP表达显著上升,并与HIF-1α的表达呈正相关。因此我们推测乳腺癌组织内缺氧会上调NKAP表达,进而调控肿瘤细胞的生长和转移。本研究旨在发现缺氧对乳腺癌细胞的功能影响,并阐明新的缺氧靶蛋白,NKAP,在肿瘤缺氧过程中的作用及具体机制。方法:在本研究中,将不同浓度的CoCl2(50,100,150和200μM)和乳腺癌细胞MCR-7体外一起培养以找到最佳的低氧模型。通过qRT-PCR和western blot检测不同浓度CoC12处理下,HIF-1 α、CXCR4和VEGF的表达情况,以明确缺氧微环境。随后通过显微拍照和TUNEL实验检测缺氧微环境下乳腺癌细胞生物学行为的变化。并利用CCK8实验分析缺氧对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响。通过western blot检测明确缺氧对乳腺癌细胞MCF-7中NKAP表达的影响。在缺氧环境下敲低NKAP,研究缺氧和NKAP敲低同时进行对乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移的影响。结果:1.CoCI2 诱导 HIF-1α,CXCR4 和 VEGF 的表达2.CoCl2促进MCF-7细胞凋亡3.CoCl2抑制MCF-7细胞增殖4.缺氧诱导NKAP表达5.缺氧和NKAP敲低同时进行对MCF-7细胞功能的影响结论:CoCl2模拟的缺氧条件可以显著诱导乳腺癌细胞MCF-7中HIF-1α,CXCR4和VEGF的表达,且与CoCl2的浓度和处理时间有关。即体外肿瘤细胞内的缺氧及其对细胞的影响是一个动态过程。CoCl2模拟的低氧条件在MCF-7细胞中产生细胞毒性,并诱导了细胞凋亡。低氧能够诱导乳腺癌细胞MCF-7中NKAP的表达。当缺氧和NKAP敲低同时进行时,细胞增殖的抑制作用加剧,但NKAP敲低阻碍了缺氧对细胞迁移的促进作用。这些初步结果表明,在乳腺癌细胞MCF-7中,缺氧信号途径和NKAP参与的信号途径可能存在串话。即在细胞迁移方面,可能具有协作效果;而在细胞的增殖和存活方面可能具有拮抗作用。NKAP是一个非常有趣的,跟乳腺癌发展和缺氧都密切相关的靶蛋白。具体机制仍然等待我们的探索。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

图１邋（Ａ）邋ＮＫＡＰｍＲＮＡ表达水平的盒型图。红色和灰色的盒子分别代表了乳腺癌肿瘤逡逑组织和正常组织。所用的数据来源于ＴＣＧＡ数据库。Ｙ轴代表ｌｏｇ２基因表达水平。（Ｂ）逡逑ＮＫＡＰ高表达或低表达的乳腺癌患者的存活率。所有数据来源于ＧＥＰ１Ａ。逡逑Ａ邋一逡逑｜邋１－０－１逡逑０．８邋－逡逑！？．６－邋＿邋曑邋ｔ逡逑ｉ：ｔｉ邋ｎ邋■邋■逡逑ｉ逦ＮＣ邋１＃逦２＂逦３／／邋４ｆｉ逡逑Ｂ逦Ｃ逡逑＜邋１．５－逡逑ｎｋａｐ邋ｍｍｍ邋ｍｒｎ＾邋：邋２邋］邋0．逡逑Ｉ逦ａ逡逑ＧＡＰＤＩｌ逦Ｊ０＇逦，逦．逡逑

图２ｓｉＮＫＡＰ使ＮＫＡＰ表达显著下调

＾逦Ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＭＣＦ７邋ｃｅｌｌｓ逡逑Ｌ５１逦＊邋—ｒ逡逑一逦ｓｉＮＫＡＰ逡逑Ｉ邋１．０－逡逑丨。５逡逑°＇°邋Ｏｈ逦２４ｈ逦４８邋ｈ逦７２邋ｈ逡逑Ｂ邋Ｃ邋２０００］逡逑｜邋）５00－邋ｒ＾ｆ￣逡逑．．二，＼邋１邋１０００－邋■逡逑、／？，逦１邋Ｉ邋－＾邋＾逡逑ＮＣ逦ｓｉＮＫＡＰ逦ＮＣ逦ｓｉＮＫＡＰ逡逑图３邋ＮＫＡＰ敲低抑制了邋ＭＣＦ－７细胞增殖和克隆形成能力。（Ａ）通过ＣＣＫ８实验检测细胞逡逑增殖情况；（Ｂ、Ｃ）利用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。＊Ｐ＜０．０５。逡逑、°６，，０

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 邵志强,郑少斌,肖耀军,谭万龙,陈彤,齐桓,姜耀东,郁兆存,张辉见;缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子在肾细胞癌组织中的表达及意义[J];第一军医大学学报;2005年08期

本文编号：2818896