拟南芥ANK-TM2基因家族的克隆与功能分析
发布时间：2020-09-15 16:12
在自然界中,植物生长常会受到各种环境因素的胁迫,例如干旱、水涝、盐碱和高温低温等。这些不良的逆境因子会对植物的生长、发育和代谢产生一系列影响,严重时更会造成植物的死亡。阐明植物抵抗不良环境因素影响的分子机制和提高植物的抗逆能力是目前植物研究领域的重要方向。本论文通过对模式植物拟南芥的未知功能基因ANK-TM2基因家族进行初步功能研究,来探讨这些基因在植物逆境响应过程中的作用。首先从NASC购买目的基因T-DNA插入的突变体种子,筛选获得纯合体突变体植株,比较这些突变体在不同逆境胁迫下与野生型拟南芥的表型差异,判断这些基因在不同植物逆境响应中的作用。得到初步结果后,再应用分子生物学技术分别构建候选基因的不同表达载体,通过农杆菌浸染法转化拟南芥,筛选出纯合表达载体植株,进一步深入研究这些基因的功能和作用机理。目前主要的研究结果如下:(1)获得ANK-TM2基因家族中各个基因的T-DNA纯合突变体:根据ANK-TM2基因家族基因序列信息,从NASC的T-DNA插入突变体库中查找相关基因的T-DNA插入突变体,购买相应突变体种子,经过多轮PCR鉴定,获得这些基因的纯合突变体植株。(2)ANK-TM2基因家族纯合突变体中目标基因表达量与野生型不同:利用荧光定量PCR(RT-qPCR)检测目标基因在突变体和野生型拟南芥中的表达量变化,结果显示,突变体ank-tm203、ank-tm204中目标基因表达量相比野生型Col-0明显降低;而ank-tm207、ank-tm208中目标基因表达量相比野生型Col-0明显升高。考虑到不同T-DNA插入位点会导致不同的表达量变化,我们认为这些基因的表达量都发生了改变,可以用于下一步逆境响应的生理表型研究。(3)ANK-TM2基因家族纯合突变体在高钙、高盐、干旱等非生物胁迫中有一定的生理表型:对获得的纯合突变体进行干旱、高盐和低钙高钙等处理,通过观察它们在不同处理下与野生型植株的表型差异,分析比较目标基因在植物逆境响应中的作用,结果表明:突变体ank-tm204在0mM CaCl_2条件下根长比野生型植株短;ank-tm208在0mM CaCl_2条件下,根长比野生型植株长;ank-tm207在高钙、高盐、干旱等条件下均比比野生型植株短。可见,ANK-TM204、ANK-TM208和ANK-TM207基因在植物响应外界钙胁迫、盐胁迫和干旱胁迫中有可能起到重要的作用。(4)ANK-TM2基因家族纯合突变体在生物胁迫中也具有一定生理表型:用PsmES4326注射侵染拟南芥野生型和纯合突变体,通过比较侵染2-3天后叶片中的菌斑量来判断拟南芥植株的抗病性强弱,结果表明:突变体ank-tm202、ank-tm204、ank-tm207和ank-tm208都表现出明显的抗病性。(5)利用Gateway技术构建了ANK-TM2基因家族的植物表达载体为进一步功能研究做准备:以pGWB406,pGWB502Ω,pGWB533这三种表达载体为基础,分别构建ANK-TM204、ANK-TM207和ANK-TM208这三个基因的GFP融合表达载体,超表达载体,以及GUS融合表达载体,以便进一步深入研究这些基因的功能和作用机理。
【学位单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：
图1.1植物与病原菌互作模式图igure1.1Azigzag model illustrates interactions between pathogen and pl南芥ANKTM家族基因概况蛋白（ankyrin）广泛存在于各种组织细胞中，它的主要结构特征是复序列模体（ankyrin repeat motif，ANK），其作用是把膜蛋白连接白网络中，细胞骨架对于维持细胞形态起关键作用。细胞中的众多可以将细胞器连接到细胞骨架上，如高尔基体、内质网等。锚蛋白有重要作用，细胞信号转导、mRNA 转录以及胞内蛋白质的转运的参与。研究还发现锚蛋白可能参与调控细胞凋亡和信号转导的过李东屏, 2005; Li et al., 2006）。蛋白是一种调节蛋白，含有锚蛋白重复序列的蛋白广泛存在于各种
图1.2 ANK重复序列Figure 1.2 TheANK repeat consensusANK 重复序列保守性越强，其构成的蛋白质的功能就越相似（吴,2005）。ANK 重复结构域主要由 β 片层和 α 螺旋构成，并折叠成 β2α2 结构奎等,2008）。整个结构域像一只弯曲的手，β 片层形成手指，螺旋平面形，手指平面与手掌平面相互垂直，在“手心”内部形成了一个疏水性的深守残基可能参与每个独立重复单位的构建或形成各重复单位之间互作的基，对整个 ANK 结构域起到稳定作用。ANK 结构域示意图如 1.2 所示（Ral., 1998; Li et al., 2006; Kovalchuk et al., 2013）。
图1.4具有代表性的ANK蛋白质结构示意图Figure1.4 Schematic diagram of representative ANK proteins 参与植物自身的防御病原体入侵植物时，会被其细胞表面的受体所识别，从而激活植物的免抵抗病原菌的侵入。在免疫信号传导的过程中，锚蛋白作为重要的调节到了重要的作用（吴利民和李东屏,2005;Li et al., 2006）。目前已经确定反应的锚蛋白主要有 At-Phos43、AKP2、ANK1、ACD6 和 NPR1 等（W006; Cristina et al., 2012; Fu et al., 2012; Louis et al., 2012; Kovalchuk e例如：Scott 等从拟南芥中得到了 AtPhos43。当植物被病原菌侵入后43 被磷酸化，其 C-末端含有 2 个锚蛋白单元,可能具有介导蛋白质的识。还有另一类基因，它们调控表达的蛋白可以抑制病毒基因的表达，比性的是 GABPβ，它调控表达的蛋白是一类含有 ANK 的蛋白质，它的结
本文编号：2819185
【学位单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：
图1.1植物与病原菌互作模式图igure1.1Azigzag model illustrates interactions between pathogen and pl南芥ANKTM家族基因概况蛋白（ankyrin）广泛存在于各种组织细胞中，它的主要结构特征是复序列模体（ankyrin repeat motif，ANK），其作用是把膜蛋白连接白网络中，细胞骨架对于维持细胞形态起关键作用。细胞中的众多可以将细胞器连接到细胞骨架上，如高尔基体、内质网等。锚蛋白有重要作用，细胞信号转导、mRNA 转录以及胞内蛋白质的转运的参与。研究还发现锚蛋白可能参与调控细胞凋亡和信号转导的过李东屏, 2005; Li et al., 2006）。蛋白是一种调节蛋白，含有锚蛋白重复序列的蛋白广泛存在于各种
图1.2 ANK重复序列Figure 1.2 TheANK repeat consensusANK 重复序列保守性越强，其构成的蛋白质的功能就越相似（吴,2005）。ANK 重复结构域主要由 β 片层和 α 螺旋构成，并折叠成 β2α2 结构奎等,2008）。整个结构域像一只弯曲的手，β 片层形成手指，螺旋平面形，手指平面与手掌平面相互垂直，在“手心”内部形成了一个疏水性的深守残基可能参与每个独立重复单位的构建或形成各重复单位之间互作的基，对整个 ANK 结构域起到稳定作用。ANK 结构域示意图如 1.2 所示（Ral., 1998; Li et al., 2006; Kovalchuk et al., 2013）。
图1.4具有代表性的ANK蛋白质结构示意图Figure1.4 Schematic diagram of representative ANK proteins 参与植物自身的防御病原体入侵植物时，会被其细胞表面的受体所识别，从而激活植物的免抵抗病原菌的侵入。在免疫信号传导的过程中，锚蛋白作为重要的调节到了重要的作用（吴利民和李东屏,2005;Li et al., 2006）。目前已经确定反应的锚蛋白主要有 At-Phos43、AKP2、ANK1、ACD6 和 NPR1 等（W006; Cristina et al., 2012; Fu et al., 2012; Louis et al., 2012; Kovalchuk e例如：Scott 等从拟南芥中得到了 AtPhos43。当植物被病原菌侵入后43 被磷酸化，其 C-末端含有 2 个锚蛋白单元,可能具有介导蛋白质的识。还有另一类基因，它们调控表达的蛋白可以抑制病毒基因的表达，比性的是 GABPβ，它调控表达的蛋白是一类含有 ANK 的蛋白质，它的结
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 戴景程;黄建国;王春连;赵开军;;病原菌保守性特征分子及其介导的植物抗病性[J];微生物学通报;2012年04期
2 卢从明,张其德,匡廷云,王忠,高煜珠;水分胁迫抑制水稻光合作用的机理[J];作物学报;1994年05期
本文编号：2819185
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