广谱抗稻瘟病基因Pi2-2的克隆及育种应用

发布时间：2020-09-18 10:49

　　稻瘟病是一种真菌性水稻病害,严重影响水稻的产量与品质。生产上对稻瘟病的防治主要依靠喷施化学药剂,但长期使用化学试剂将导致稻瘟病菌产生耐药性而使得该化学药剂失去防治功能,更严重的是危害生态平衡、影响人类身心健康。而种植具有广谱持久抗性水稻品种,既可降低水稻的生产成本又可促进环境的可持续发展。因此,挖掘和鉴定稻瘟病抗性基因资源,分离并克隆广谱持久稻瘟病抗性基因,对于研究抗性基因的抗病机理、解析抗性基因与病原效应因子之间的互作机制以及培育广谱抗稻瘟病水稻品种都具有十分重要的意义。Jefferson是引自美国的一个籼稻血缘水稻品种,对不同来源的42份稻瘟菌生理小种产生抗性。目标基因Pi2-2被定位于水稻品种Jefferson第6号染色体上靠近短臂端着丝粒附近,被界定在标记RM19817和AP5659-3之间的0.17 cM范围内,物理距离约270 kb,与已克隆的广谱抗瘟基因Pi9、Pi2、Pi50、Pigm和Piz-t等互为等位基因。在前期BAC末端测序的基础上分析发现,获得的两个阳性克隆所构成的重叠群覆盖整个Pi2/9基因位点,暗示目的基因Pi2-2被包含在这两个克隆中。本研究以广谱抗稻瘟病水稻品种Jefferson为材料,在前期研究基础上,测序分析阳性BAC克隆,进一步克隆目的基因,分析水稻Pi2/9位点中稻瘟病功能抗性基因的分子进化特点,同时利用Pi2-2基因开展分子标记辅助选择育种实践。取得结果如下:1.分离了Pi2-2候选基因并完成了蛋白结构分析。采用同源克隆的策略分离获得了Pi2-2候选基因的完整序列。Pi2-2候选基因序列全长8601 bp,包括3个外显子和2个内含子;基因编码序列全长3099 bp,编码一个包含1032个氨基酸的CC-NBS-LRR类型亲水蛋白。蛋白分子式C_(5184)H_(8402)N_(1428)O_(1536)S_(44),相对分子质量116721.02 Da,理论等电点PI为6.95。2.完成了Pi2-2候选基因(蛋白)的分子进化分析。分离得到的Pi2-2候选基因启动子区相对Pi9基因启动子而言,有6个InDel插入,合计插入了268个核苷酸,编码区序列与Pi9基因的编码区序列相似性与同源性同样高达99%,仅在第二个外显子区存在个别SNP突变。Pi2-2蛋白与Pi2蛋白间存在44个氨基酸的差异,与Pi9蛋白间存在12个氨基酸差异,与Piz-t蛋白间存在48个氨基酸的差异,与Pigm和Pi50两个蛋白间均存在41个氨基酸差异。进化上与Pi9聚类在一个簇中,与广谱抗瘟基因Pi9具有更近的亲缘关系和更高的同源性,氨基酸的差异也主要存在于C端的LRR区。3.对候选基因Pi2-2进行了CRISPR/Cas9编辑。采用CRISPR/Cas9基因编辑的方法,针对候选基因Pi2-2设计了2个靶位点,通过农杆菌介导的遗传转化获得Jefferson背景下转基因T_0代植株12株,其中编辑植株6株,有包括缺失和插入5种类型的突变,3株纯合突变和3株杂合突变,基因编辑率为50%。第一种突变类型导致基因在突变位点直接删除1个氨基酸而不引起其他氨基酸的改变;第二种突变类型、第三种突变类型以及第四种突变类型均导致基因编码序列提前终止,仅编码了1022个氨基酸;第五种突变类型是发生了非同义突变,仅该位点的氨基酸发生改变,而其他位点的氨基酸无变化。目前,获得了LRR靶点的转基因植株,将用于后续的稻瘟病抗性分析,验证候选基因功能。4.利用Pi2-2基因开展了水稻稻瘟病抗性定向改良的分子育种实践。根据Pi2-2候选基因的序列,开发获得了1对基于PCR的共显性DNA标记Pi2-2 Pro.1,标记在Jefferson基因组中扩增出一条大小为701 bp的明显而稳定的条带,在95份水稻品系基因组中扩增出一条450 bp的条带,所占比率为98.96%。通过对蜀恢527×Jefferson的BC_1F_1回交群体进行辅助选择效率分析,其对后代的选择效率为100%,表明可以利用该标记有效地开展抗瘟基因Pi2-2的分子标记辅助选择育种。同时,结合回交育种方法与分子标记辅助选择技术,以Jefferson为Pi2-2基因供体亲本,以E32、He85、CO1403、蜀恢527、桃1B等5份籼稻品系为受体亲本及轮回亲本,定向改良其稻瘟病抗性,已获得5个组合的BC_1F_1群体,为进一步培育抗病新品系奠定了基础。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S435.111.41

【参考文献】