禽网状内皮组织增生症病毒gp90基因原核表达产物在检测和预防REV中的应用

发布时间：2020-09-19 12:29

　　禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendosiliosis virus,REV)引起的禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是一种重要的禽类免疫抑制性疾病和肿瘤性疾病,REV不仅可以感染鸡,还能够感染野鸡、鸭、火鸡、鹌鹑、鹅等。REV既能够垂直传播,也可以水平传播,除此之外使用了被REV污染的弱毒疫苗也是导致REV广泛流行的重要原因之一。目前,种源净化是彻底解决REV传播的最主要途径,但是迄今为止,还没有哪个国家专门提出针对REV的净化计划。本研究以一株REV疫苗污染毒核酸为模板,成功表达了其gp90蛋白并制备了针对gp90蛋白的单克隆抗体,将该蛋白与免疫佐剂CpG-ODN联合应用成功诱导母鸡产生针对REV的抗体并保护雏鸡抵抗REV感染,为REV的检测和防控提供了新的技术储备。1.REV gp90蛋白的表达及抗REV间接ELISA方法的建立以REV疫苗污染株IBD-C1605株的前病毒全基因cDNA克隆质粒为模板,通过PCR扩增,扩增出长度为1,200 bp的env-gp90基因片段,成功构建了PET-28a-gp90表达质粒,转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导、并通过SDS-PAGE蛋白质电泳检测,显示gp90蛋白获得高效表达。对包涵体蛋白洗涤、溶解,4℃复性后纯化。对该蛋白进行检测分析,结果显示,REV单克隆抗体11B118能够很好地识别gp90重组蛋白,该蛋白具有良好的反应原性。将纯化后的gp90蛋白作为包被抗原,建立了抗REV抗体的间接ELISA检测方法。优化ELISA的最佳工作条件,结果显示为抗原的包被的最佳浓度是10 mg/mL,一抗的最佳稀释度1:500,二抗最佳稀释度1:5000,最佳包被液TBST,最佳显色时间10 min。经过重复性试验、特异性试验、对比试验的结果显示本研究建立的ELISA方法重复性好,标准差均小于15%;特异性强,与马立克氏病毒(Marik’s disease virus,MDV)、禽白血病病毒(Avain leukosis virus,ALV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)、禽痘病毒(Fowlpox virus,FPV)等病毒的阳性抗体均不能产生交叉反应;结果可靠性好,与间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)准确性的吻合率都超过90%。2.抗REV-gp90蛋白单克隆抗体的制备gp90蛋白纯化后,免疫BALB/c小鼠,用PEG2000介导BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。经有限稀释法进行亚克隆,筛选单克隆抗体,4代之后,得到了1株能稳定分泌REV-gp90单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A12D。进一步分析表明,gp90蛋白可以被1A12D株杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体特异性的识别,同时也能够特异性地识别REV全病毒。向经石蜡致敏的BALB/c小鼠注射该株杂交瘤细胞,制备腹水,检测小鼠腹水所含抗体效价,结果显示均超过1.2×10~4;建立检测REV间接免疫荧光(IFA)的方法,用该方法对MDV、ALV、FPV、IBDV、NDV等几种常见的鸡病毒进行特异性试验,结果均呈阴性,说明该方法对REV检测具有高度特异性。重复性试验结果显示该方法具有良好的可重复性,稳定性强。3.齐多夫定和单克隆抗体联合应用去除疫苗毒种中REV的污染为了将污染REV的某传染性法氏囊病疫苗的种毒进行纯化,将所制备的单克隆抗体同核苷类逆转录酶抑制剂类药物齐多夫定(Azidothymidine,AZT)分别单独使用及联合应用来去除疫苗毒种中REV的污染。将污染REV的IBDV疫苗毒种接种DF-1细胞后,分别经5μg/mL的AZT,5%的McAb或两者联合应用干预后,毒种中污染的REV复制受到了明显的干扰,特别是经过AZT与McAb联合应用两次干预后,检测REV为完全阴性,经检验传染性法氏囊毒种纯化合格。4.gp90蛋白协同分子佐剂CpG-ODN诱导母源抗体保护雏鸡抵抗REV的感染为进一步观察所表达gp90蛋白的免疫原性,将纯化后的gp90蛋白协同免疫佐剂CpG-ODN使用于开产SPF母鸡10只,连续免疫8周,同时对母鸡血清以及卵黄抗体进行REV抗体水平检测,绘制抗体动态曲线,结果显示在免疫后母鸡血清及卵黄抗体均到达较高水平。将该鸡胚进行人工授精,孵化后检测1日龄雏鸡的母源抗体水平,选取抗体阳性鸡进行人工攻毒试验,以1日龄抗体阴性的SPF雏鸡作为对照组。结果显示,有母源抗体的雏鸡REV病毒血症阳性率从一周龄的50%最后下降至10%,而对照组的病毒血症阳性率从第一周的80%下降到最后的50%,说明母源抗体能够保护大部分雏鸡免受REV感染。综上所述,本研究研制的针对gp90蛋白的单克隆抗体在检测和去除REV污染中均可发挥有效作用,并可与分子佐剂联合诱导产生母源抗体保护雏鸡抵抗REV的感染。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

示意图,病毒结构,示意图

REV病毒结构示意图

示意图,基因组结构,示意图,病毒

图 2 REV基因组结构示意图Fig.2 Genome of Reticuloendotheliosis virus陷型禽网状内皮组织增生症病毒可以在几种禽类细胞中增殖，特别是鸡胚、鹑成纤维细胞最常用。李劲松报道，用鸭胚、鸭肾细胞也能很好地繁殖病毒成纤维细胞很适合于细胞病变的观察。禽网状内皮组织增生症病毒在其他细

化学结构,胸腺嘧啶核苷酸,核糖核酸,逆转录酶

图 3 AZT 化学结构Fig.3 Chemical structure of AZT图 4）：由于脱氧胸腺嘧啶核苷酸（T）与 AZ的过程中，逆转录酶错将 AZT 加以利用，但与另一边的核糖核酸上的 5’的羟基与磷酸

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