对酚类物质进行修饰合成酚类衍生物的基因工程菌的构建

发布时间：2020-09-19 14:05

　　对羟基苯甲酸,香兰素等酚类化合物广泛应用于人们的日常生活。虽然这些化合物可通过化学合成,然而,在食品,化妆品和制药等应用领域,人们更青睐天然或生物合成的产品。因此,利用现代生物技术构建微生物细胞工厂生产酚类衍生物的前景广阔。另外,通过异养微生物利用二氧化碳合成一些有价值的化合物是一种很有前景的生物合成手段。本研究以大肠杆菌为出发菌株,导入相应羧化酶和还原酶基因构建基因工程菌,以实现对酚类物质进行加羧和对羧基进行还原等生物合成过程。本研究将来自枯草芽孢杆菌168的羧化酶基因ylBCCD,来自诺卡氏菌NRRL 5646中羧酸还原酶基因car和来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基转移酶Sfp连接到pETDuet质粒,构建了pETDuet-yclBCD-car-s p质粒;将丝孢酵母菌WU-0401的水杨酸脱羧酶基因Sdc,以及来自诺卡氏菌NRRL 5646中羧酸还原酶基因car和来自枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰疏基转移酶sfp连接到pETDuet质粒,构建了pETDuet-sdc-car-sfp质粒。将两种质粒分别导入到在大肠杆菌B121(DE3)中,构建了 pETDuet-yclBCD-car-sfp/B121(DE3)和pETDuet-sdc-car-sfp/B121(DE3)重组菌株。在有氧条件下,以苯酚和碳酸氢钠(提供C02)为底物,进行了发酵实验,用高效液相色谱仪和液质联用色谱仪对产物进行了分析,分别考察了两株重组菌对底物转化能力。发现重组菌pETDuet-yclBCD-car-sfp/B121(DE3)不仅可以转化苯酚和CO2生成4-羟基苯甲酸,同时还有还原产物4-羟基苯甲醛和4-羟基苯甲醇生成。含重组质粒pETDuet-yclBCD-car-sfp的工程菌经12h发酵最终得到4-羟基苯甲醇11.331±1.882 mg/l。然而,同样条件下以愈创木酚和碳酸氢钠为底物并没有检测到预期加羧和还原产物,说明羧化酶YCLBCD对底物具有特异性,并不能催化愈创木酚的加羧。另外,以苯酚和碳酸氢钠(提供C02)为底物,用含质粒pETDuet-sdc-car-sfp的重组菌发酵只得到加羧产物水杨酸,未检测到还原产物水杨醛或水杨醇,证明水杨酸脱羧酶Sdc可以催化苯酚加羧生成水杨酸,而羧酸还原酶CAR并不能催化水杨酸还原。
【学位单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

过程图,脱羧酶,脱羧,水杨酸

脱羧酶催化２，邋６－二羟基苯甲酸酯和２，邋３－二羟基苯甲酸酯的非氧化脱羧作用，不需要逡逑任何辅助因子。还有一些脱羧酶可以在需氧条件下催化羧化过程。逡逑发现水杨酸脱羧酶可以可逆地催化苯酚和Ｃ0２反应生成水杨酸（图１－１）。Ｌｕｐａ等报逡逑道了一种来自枯草芽孢杆菌的可逆非氧化香草酸／４－羟基苯甲酸脱羧酶，其可以在有氧逡逑和无氧条件下使香草酸和４－羟基苯甲酸脱羧［５８：６６］。这些过程可以可逆地进行，并且羧逡逑化不需要ＡＴＰ，并且其中没有显着的能量变化。因此，这一步骤不是牢固的碳固定过逡逑程。从合成生物学的观点来看，合成的化合物种类受到限制，仅得到少量苯甲酸衍生逡逑物。如果引入的羧基可以进一步转移到其它基团，贝Ｕ不仅富含Ｃ０２添加到酚类底物的逡逑产物，而且可以获得许多有价值的化合物。例如，据报道，天麻蛋白，即４－羟甲基苯逡逑基Ｐ邋－Ｄ－ｆｌ比喃葡萄糖苷被鉴定为Ｇ．邋ｄａｔａ邋Ｂｌｕｍｅ的主要活性成分，并被广泛用于治疗各逡逑种疾病如头痛

分支酸,羟基苯甲酸,诺卡氏菌,还原反应

图１－２诺卡氏菌ＮＲＲＬ邋５６４６中ＣＡＲ催化的还原反应逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋Ｎｏｃａｒｄｉａ邋ｓｐ．邋ｓｔｒａｉｎ邋ＮＲＲＬ邋５６４６ＣＡＲ．逡逑

分支酸,羟基苯甲酸

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【参考文献】