代谢途径关键基因LDH在甲状腺未分化癌中的研究

发布时间：2020-09-19 20:32

　　背景与目的甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)是影响人类的最具侵袭性的实体瘤之一,诊断后中位生存期为3至5个月。1年和10年生存率分别预估为10-20%和小于5%。虽然也有文献发表有长期幸存的患者,但这种案例的诊断可靠性常常受到质疑。尽管甲状腺未分化癌仅占全部甲状腺恶性肿瘤的1-3%,但每年高达14-50%的甲状腺癌相关死亡与其相关。ATC治疗方法有限,通常对标准的放疗及化学治疗不敏感,因此了解ATC肿瘤的能量代谢和分子发病机制可能为该疾病的治疗提供新的希望。我们知道癌症细胞和非癌细胞在其生长代谢的过程中有很大的差别,许多癌细胞的代谢方式会被基因重新编程。正常细胞在组织内氧气充分的情况下,主要通过在线粒体内三羧酸循环的方式代谢葡萄糖产生能量,一般在缺氧的情况下,才会通过糖酵解代谢的方式,将丙酮酸转化成乳酸,快速供能。一旦氧气充足后,乳酸会逆向转换成丙酮酸,重新进入线粒体内,氧化还原,最终生成二氧化碳、水和ATP。但是癌症细胞即使在氧气充足的情况下,也会利用糖酵解,而不是线粒体氧化磷酸化的方式来代谢葡萄糖供能。这种现象被称之为Warburg效应。乳酸脱氢酶(LDH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的细胞糖酵解代谢途径中的关键酶。其在癌细胞中的表达对肿瘤细胞生长代谢的维持、以及肿瘤恶性表型的发生、进展都有影响。LDH是由不同位置的基因编码的两个不同的亚单位(LDHa和LDHb)组成的四聚体。LDH可催化丙酮酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)与乳酸和NAD+的相互转化。催化方向多取决于LDH复合物中两种不同的亚单位LDHa和LDHb所构成的酶的比例,一般认为LDHa促进丙酮酸还原成乳酸盐伴随着NADH脱氢转化为NAD+,而LDHb则有利于向相反的方向催化。本课题我们以癌细胞的较为独特的能量代谢方式,即糖酵解代谢为研究切入点,首先通过oncomine数据库分析确定LDH基因在不同病理类型的甲状腺癌中表达有差异。随后通过构建经多西环素(Doxycycline,DOX)控制表达的重组慢病毒载体Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb,感染甲状腺未分化癌Hth83细胞系,建立稳定的基因沉默可控的细胞系。然后对该慢病毒感染的细胞行单克隆筛选,找到LDHa、LDHb基因表达可被持续、稳定沉默的单克隆细胞系。研究shLDHa、shLDHb基因的表达,对ATC细胞系肿瘤表型的影响及其对乳酸脱氢酶活性和下游产物乳酸产生的影响;进一步我们还建立了裸鼠的甲状腺区原位移植瘤模型,观察诱导下调LDHa基因的ATC细胞系在裸鼠体内的成瘤能力;验证在裸鼠体内抑制LDHa基因对肿瘤乳酸脱氢酶蛋白的生成及酶活性的影响。本课题的研究不仅有助于阐明肿瘤代谢途径中关键酶LDH在ATC中的生物学功能和对肿瘤生长代谢的影响,还可能为ATC的治疗提供新的思路和干预靶点。第一章:重组慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC细胞系Hth83中的制备及生物功能的研究第一部分:重组慢病毒Lenti-shLDHa及Lenti-shLDHb在ATC细胞系Hth83中的制备、鉴定及单克隆筛选方法1.扩增可诱导表达基因沉默的线性化载体p Inducer-EmGFP-mirRNA。2.设计LDHa、LDHb基因的干扰片段,制备线性化干扰载体,经退火、连接、转化、鉴定,构建LDH基因干扰慢病毒载体Lenti-shLDHb、Lenti-shLDHa。3.慢病毒进行包装、纯化、浓缩,利用梯度稀释法测定病毒滴度,用感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)=10、25、50、75、100、200、500对Hth83细胞感染后,通过荧光观察测定绿色荧光细胞占细胞总数的比例。4.重组慢病毒Lenti-LDHa和Lenti-shLDHb感染成功后,分别观察细胞形态学变化,MTT实验检测细胞增殖能力,Western-blot检测蛋白的表达情况。5.Hth83-shLDHa细胞系于DOX 0.1μg/mL作用后,收集混合细胞悬液,送流式细胞仪分选单细胞株种植于96孔板内,培养10-14天取单克隆增殖株消化扩增,Western-blot检测蛋白表达。筛选出经DOX诱导表达后,LDHa被高效抑制的单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31。6.Hth83-shLDHb细胞系于DOX 0.1μg/mL作用后,收集混合细胞悬液,送流式细胞仪分选单细胞株种植于96孔板内,培养10-14天取单克隆增殖株消化扩增,Western-blot检测蛋白表达。筛选出经DOX诱导表达后,LDHb被高效抑制的单克隆细胞系Hth83-shLDHb-6,Hth83-shLDHa-18。结果1.在原有Hth83细胞系成功转染Luciferase蛋白的基础上,成功构建了慢病毒感染的LDH抑制表达可控的细胞系Hth83-shLDHa、Hth83-shLDHb,绿色荧光显示表达效率高达75%以上,可以满足后续实验要求。2.不同DOX浓度和时间下诱导抑制shLDHa、shLDHa基因表达后,Western-blot检测显示LDHa、LDHb蛋白表达均可得到明显的抑制。高浓度DOX诱导抑制后显微镜下观察Hth83细胞生长受抑,细胞分散,可见细胞碎片,细胞挛缩。3.不同DOX浓度、时间诱导抑制LDH基因后,MTT检测显示者在10μg/mL DOX浓度处理组,细胞增殖能力的下降具有显著的统计学差异。4.分别成功筛选出单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18,在不同DOX浓度及不同作用时间的诱导下Western-blot验证LDHa、LDHb蛋白均能被高效抑制,从而找到最佳抑制剂量及最佳作用时间,为下一步的细胞功能实验打基础。第二部分:单克隆Hth83细胞系中抑制LDH表达对细胞功能、酶活性及乳酸的影响方法1.乳酸检测试剂盒检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达后,细胞内乳酸生成的变化。2.利用乳酸脱氢酶试剂盒检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达,细胞内乳酸脱氢酶的活性。3.以MTT法检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达,对细胞增殖能力的影响。4.平板实验法检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18经DOX诱导shLDHa、shLDHb基因的表达,对细胞单克隆形成能力的影响。5.划痕实验法检测单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31经DOX诱导shLDHa基因的表达,对细胞迁徙能力的影响。6.利用流式细胞仪检测单克隆细胞系细胞Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31经DOX诱导shLDHa基因的表达,检测凋亡细胞数改变。结果1.以加入DOX后诱导shLDHa、shLDHb表达的为实验组,不加DOX的为对照组。当DOX作用Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞24小时后,实验组较对照组乳酸含量下降(p0.05);但作用96小时后乳酸含量实验组较对照组无明显差异;且不同浓度的DOX诱导对肿瘤乳酸的产生无明显差异(p0.05)。DOX作用Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18细胞24小时后,高浓度DOX诱导组乳酸的产生均出现轻度降低;但在Hth83-shLDHb-18细胞低浓度实验组乳酸含量与对照比较无明显差异(p0.05)。作用96小时后乳酸的产生在Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18细胞高、低浓度DOX实验组较对照组均无差异(p0.05)。2.实验组加入DOX沉默Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞LDHa表达后,乳酸脱氢酶活性较对照组均明显降低(p0.05)。且高浓度DOX诱导组较低浓度组,乳酸脱氢酶活性降低更明显;随着作用时间延长到96小时,乳酸脱氢酶活性进一步减低(p0.05)。Hth83-shLDHb-18细胞DOX作用24小时后乳酸脱氢酶活性较对照组轻度降低(p0.05);但Hth83-shLDHb-6实验组较对照组,乳酸脱氢酶活性无差异(p0.05)。96小时组Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18实验组较对照组乳酸脱氢酶活性无明显差异(p0.05)。3.Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞实验组以DOX诱导24小时后,较对照组细胞活性无明显差异;DOX诱导48、72、96小时后实验组较对照组细胞活性明显降低,且随着DOX抑制浓度的增加,细胞活性明显降低(p0.05)。Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18细胞系DOX诱导24、48、72小时后,实验组较对照组细胞活性无明显差异;DOX诱导96小时后实验组较对照组细胞活性降低(p0.05)。4.抑制LDHa、LDHb基因的表达,单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31、Hth83-shLDHb-6、Hth83-shLDHb-18均出现显著的细胞克隆形成抑制(p0.01),且相较于对照组随着实验组DOX浓度的增加,克隆形成能力也随之减弱。5.DOX诱导shLDHa抑制LDHa的表达后,单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31,实验组和对照组间肿瘤细胞的迁移距离无统计学差异(p0.05)。6.实验组以不同浓度的DOX抑制LDHa的表达后,单克隆细胞系Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31未出现明显的凋亡峰,且相较于对照组细胞周期数无明显差别(p0.05)。第二章:抑制LDH对裸鼠移植瘤生长及代谢的研究方法1.于裸鼠甲状腺内原位种植Hth83-shLDHa-4、Hth83-shLDHa-31细胞系,建立人移植瘤动物模型。2.注射后第5天开始,分别给予含有和不含有DOX的饮食,诱导shLDHa基因的表达,每两至三天应用影像系统动态监测肿瘤体积变化和瘤重。3.实验组及对照组分别给予含或不含DOX的饮食,待移植瘤模型建立稳定后,每组分别取出3只裸鼠的移植瘤组织,用蛋白印迹实验检查移植瘤组织内LDHa表达。4.实验组及对照组分别给予含或不含DOX的饮食,待移植瘤模型建立稳定后,每组分别取出3只裸鼠的移植瘤组织,用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测组织内LDH的活性。5.监测人肿瘤移植模型裸鼠的总生存期,绘制生存曲线。结果1.成功建立了LDHa基因表达下调的ATC原位裸鼠移植瘤模型。2.实验组裸鼠肿瘤生长慢于对照组,接种1周后小动物活体荧光成像系统显示实验组荧光强度显著低于对照组(P=0.003)。且实验组裸鼠剥除的瘤体体积及重量小于对照组(P=0.0031和P=0.002)。3.LDHa蛋白表达量在实验组肿瘤组织中的表达低于对照组(P=0.286)。4.乳酸脱氢酶活性在实验组肿瘤组织中的表达低于对照组(P=0.231)。5.实验组人肿瘤移植模型裸鼠的总生存期长于对照组裸鼠的总生存期。结论1.oncomine数据库中提示LDHa在甲状腺未分化癌中高表达,提示LDH在甲状腺未分化癌中有良好的研究前景。2.抑制LDHa基因能够有效抑制Hth83细胞的增殖及肿瘤克隆的形成,但对细胞的迁徙能力及细胞周期无显著影响。3.LDHa或LDHb表达的抑制,均能够有效的降低Hth83细胞内乳酸脱氢酶的活性,并暂时性的降低了乳酸的浓度。4.慢病毒转染的方法沉默LDHa、LDHb,对Hth83细胞系乳酸脱氢酶、乳酸的产生均有抑制作用;但沉默LDHa的效果要好于沉默LDHb。5.裸鼠体内表达shLDHa可抑制LDHa蛋白的生成和酶的活性。6.裸鼠体内抑制LDHa,可显著抑制人甲状腺癌移植瘤的生长,延长了异种移植瘤裸鼠的生存期。提示LDHa有可能作为ATC患者的潜在治疗靶点。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R736.1
【部分图文】：

甲状腺癌,病理类型,慢病毒,果重

结果重组慢病毒 Lenti-shLDHa 及 Lenti-shLDHb 的制备、鉴定 oncomine 数据库检测 LDH 基因在甲状腺癌中的表达图 1 中我们看出，不同病理类型的甲状腺癌 LDHa、LDHb 表达有差异，在甲状腺未分化癌中，LDHa 表达水平较高。

甲状腺癌,病理类型

oncomine 数据库检测 LDH 基因在甲状腺癌中的表达图 1 中我们看出，不同病理类型的甲状腺癌 LDHa、LDHb 表达有差异甲状腺未分化癌中，LDHa 表达水平较高。图 1A 不同病理类型的甲状腺癌 LDHa 的表达

慢病毒的包装、制备、滴度测定和对 Hth-83 细胞感染效率的慢病毒载体构建乳酸脱氢酶可调节表达的短发夹干扰 Hth83-hLDHb 细胞系。配制磷酸钙转染体系，该体系与 293T 细胞共后观察荧光情况，48 小时后再次观察荧光情况，并收集病毒上的方法来测定病毒的滴度。测定结果显示浓缩后的四种病毒FU/mL。通过对 Hth83 细胞的感染效率测定发现，当 MOI=80胞的效率可达 75%以上，可以满足进一步的实验需求，见图

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