小麦盐、碱胁迫应答基因TaWRKY46和TaNRT1.2的功能研究

发布时间：2020-09-22 16:26

　　 近年来土壤盐碱化程度的不断增加对植物生长、农业生产以及粮食供应等方面造成严重的影响。土壤中盐与碱往往是相伴而生的,盐胁迫一般会给植物造成渗透胁迫与离子损伤,而碱胁迫除了导致上述胁迫外,还会严重影响土壤的pH,阻碍植物对离子的正常吸收并扰乱细胞内离子平衡,使细胞膜、植物根系与光合系统等受损,对植物的正常生长造成极大伤害。所以人们需要对盐胁迫响应机制与碱胁迫响应机制进行深入研究,从而解决盐、碱胁迫对植物造成的损伤。实验室前期利用普通小麦济南177(JN177)和长穗偃麦草通过不对称体细胞杂交的技术,获得了一系列小麦渐渗系,并从中选育了耐盐的小麦渐渗系新品种—山融3号(SR3)与耐盐碱的小麦渐渗系新品系—山融4号(SR4)。田间种植与实验鉴定表明SR3与SR4具有很强的耐盐碱能力,其中SR3耐盐性更强,而SR4耐碱性突出。利用第二代高通量测序技术对SR3盐处理与SR4碱处理后的转录组进行分析,挑选出一个在SR3根中受盐胁迫诱导表达变化较大的WRKY家族转录因子TaWRKY46基因,一个在SR4根中受碱胁迫诱导上调表达的硝酸盐转运蛋白TaNRT1.2基因,进一步研究它们在盐碱胁迫中的功能及作用机制。1.小麦盐胁迫应答基因TaWRKY46的功能探究我们从SR3中克隆到一个约669 bp的TaWRKY46开放阅读框。对其保守结构域分析后发现它是一个WRKY类转录因子,在多种非生物胁迫处理下呈现了不同的表达模式。TaWRK46主要定位于细胞核,在酵母系统中验证了其具有体外转录激活活性。利用农杆菌介导的方法将TaWRKY46转化野生型拟南芥(Col-0),获得了两个TaWRKY46异源过量表达的纯合株系(OE)。在正常生长条件下,TaWRKY46 OE系的生长与野生型植株无明显差异,但是在盐胁迫条件下,TaWRKY46OE系的叶片面积明显小于野生型拟南芥,表现出对盐胁迫的敏感性;氧化胁迫条件下,TaWRKY46OE系的叶片面积显著大于对照,表现了对氧化胁迫的显著抗性。DAB和NBT染色结果显示TaWRKY46 OE系积累的ROS含量明显低于野生型,ROS清除酶活性也有显著提升,检测过表达系与野生型的ROS信号通路中的marker gene发现ROS清除相关的基因CAT2、FeSOD1 FeSOD3、CuZnSOD3表达上调,ROS合成相关的基因rbohC、rbohD、rbohE的表达下调,因此我们推测ROS信号通路在TaWRKY46介导的盐胁迫、氧化胁迫响应机制中发挥重要作用。此外,在施加外源ABA的条件下,OE系较野生型的生长总是被抑制的,表现出对ABA的敏感性。荧光实时定量PCR分析结果显示,TaWRKY46OE系ABA信号通路中的marker gene ABA1,ABA2,ABI5的表达量明显高于野生型,我们推测,ABA信号通路可能在TaWRKY46介导的盐胁迫响应机制中发挥重要作用。2.小麦碱胁迫应答基因TaNRT1.2功能探究我们从SR4中克隆到一个约471 bp的开放阅读框。它是一个硝酸盐转运蛋白,非生物胁迫分析显示TaNRT1.2参与到了小麦对多种胁迫环境的响应。TaNRT1.2定位于细胞膜。将TaNRT1.2转化野生型拟南芥(Col-0),获得了两个拟南芥过表达的纯合株系(OE)。在正常生长条件下,TaNRT1.2拟南芥OE系的生长发育相较于野生型拟南芥无明显差异,在碱胁迫与氧化胁迫条件下,TaNRT1.2过表达系的叶片面积显著小于对照,主根根长明显短于对照,展现了对碱胁迫与氧化胁迫的显著敏感性。DAB和NBT染色结果显示TaNRT1.2 OE系的ROS含量明显高于野生型,且实时荧光定量PCR结果显示,ROS合成相关的基因rbohC,rbohD,rbohE,brohF和rbohG表达发生明显上调,ROS清除相关的Cu/ZnSOD2,CAT2,GPX2基因的表达发生下调。此外,在施加外源ABA的条件下,OE系较野生型的生长总是被促进的,表现出对ABA的不敏感性,对ABA信号通路中的marker gene分析发现ABI1,ABI2,ABI5的表达上调。我们推测,ROS信号通路与ABA信号通路可能在TaNRT1.2介导的碱胁迫响应的机制中发挥重要作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋Ｓｔｕｄｅｎｔ！ｓ邋ｔ－ｔｅｓｔ，邋ａｔ邋＊Ｐ＜０．０５邋ａｎｄ邋＊＊Ｐ＜０．０１．逡逑经过数据分析，发现在２００邋ｍＭ邋ＮａＣＩ处理下，亲本ＪＮ１７７与ＳＲ３的叶片中，逡逑Ｔｏ灰／汉７￥６在０－４８ｈ内的表达变化均不是很明显（图３－１Ａ）；但是在ＪＮ１７７的逡逑根中的表达量在处理后的４８ｈ内发生了明显地下调，下调大约１０逡逑倍（图３－１Ｂ）；而在ＳＲ３的根中，２００ｍＭＮａＣｌ处理后的０－６ｈ内化＃兄０４５逡逑的表达量没有发生明显变化，但是在１２－４８邋ｈ期间，表达量发生了明显地上调，逡逑在１２邋ｈ时上调的倍数达到最大，大约为１２倍（图３－］邋Ｂ）。逡逑在１００ｍＭ碱处理下，％奶汉７必在ＪＮ１７７与ＳＲ３的叶中表达显著下调（图逡逑３－２Ｃ）；在ＪＮ１７７根中０．５ｈ－２４ｈ内处于上调表达，但是４８ｈ后表达发生了明逡逑显下调；而在ＳＲ３根中表达一直上调且在２４邋ｈ时上调了大约５倍（图３－２邋Ｄ）。逡逑在ｌＯＯ＾ＭＡＢＡ处理后

该基因构建到ＰＧＢＫＴ７载体上，转化酵母菌株ＡＨ１０９，并在Ｔｒｐ／Ｈｉｓ的二缺培逡逑养基上培养。逡逑如图３－４所示，转化了邋ＴａＷＲＫＹ４６－ｐＧＢＫＴ７或ｐＧＢＫＴ７空载质粒的酵母可逡逑以在Ｔｒｐ单培养基上生长，但只有转化了邋ＴａＷＲＫＹ４６－ｐＧＢＫＴ７的酵母可以在逡逑Ｔｒｐ／Ｈｉｓ二缺培养基上正常生长。这一结果是由于ＴａＷＲＫＹ４６激活结构域与逡逑ＰＧＢＫＴ７载体上的ＤＮＡ结合结构域共同作用，激活了下游基因的表达，从而赋逡逑予酵母在缺Ｈｉｓ的培养基上生长的能力。以上证据表明：ＴａＷＲＫＹ４６具有体外逡逑转录激活活性。逡逑１邋ｌ0ｘ邋ｌ00ｘ邋ｌＱＱＱｘ逦１邋ｌ0ｘ邋ｌ00ｘ邋ｌ000ｘ逡逑ＴａＷＲＫＹ４６－邋ｆ逡逑ｐＧＢＫＴ７－２逡逑Ｔｒｐ单缺培养基逦Ｔｒｐ／Ｈｉｓ二缺培养基逡逑图３－４邋ＴａＷＲＫＹ４６体外转录激活活性的检测逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－４邋Ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ＴａＷＲＫＹ４６邋ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ逡逑３．５逦转基因拟南芥纯系的筛选逡逑在各种非生物胁迫下小麦ＳＲ３中７＾股尤７￥６表达发生了明显的变化，因此逡逑为了进一步研究该基因在植物响应各种非生物胁迫中的作用，把从ＳＲ３克隆的逡逑必的ＯＲＦ通过酶切连接法构建到ｐＲＩ１０１－ＡＮ载体上，该载体可以使目逡逑的基因在双子叶植物中高效而且稳定表达。经过筛选得到Ｔ３代的纯系过表达植逡逑株，提取野生型与过表达系的ＲＮＡ，经过反转录得到ｃＤＮＡ，利用ｑＲＴ－ＰＣＲ检逡逑测该基因在过表达系中的表达量，挑取两个表达量较高的转基因株系（ＯＥ１，逡逑ＯＥ２）用于后续功能研究（图３－５）。逡逑２３逡逑

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑外源ＡＢＡ的响应过程，我们对过表达株系在对照与不同浓度ＡＢＡ胁迫处理下逡逑的生长状况进行观察，发现对照条件下的野生型与过表达系生长一致，在４邋ｐＭ、逡逑５邋ｐＭ、６邋＾ＭＡＢＡ处理下过表达系的叶片面积没有差异，但是主根长度明显比逡逑野生型短。从以上结果推测７＾＾１７４６导致了拟南芥对ＡＢＡ敏感（图３－７），逡逑可能在调控植物对ＡＢＡ胁迫的响应中发挥作用。逡逑

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 ;The alkaline tolerance in Arabidopsis requires stabilizing microfilament partially through inactivation of PKS5 kinase[J];遗传学报;2011年07期

2 江文波;余迪求;;拟南芥WRKY2转录调控因子可能参与调控渗透胁迫反应[J];云南植物研究;2009年05期

3 石德成;殷立娟;;盐(NaCl)与碱(Na_2CO_3)对星星草胁迫作用的差异[J];Journal of Integrative Plant Biology;1993年02期

相关博士学位论文 前1条

1 孟晨;小麦渐渗系山融4号根系碱胁迫响应转录组及相关基因功能研究[D];山东大学;2015年

本文编号：2824638