PinX1基因在黑色素瘤组织和细胞中的表达及功能学研究

发布时间：2020-09-22 17:49

　　 背景黑色素瘤是一种高度恶性的肿瘤,早期易发生淋巴和血道转移,对放化疗不敏感,预后差。近年来,随着各种致癌基因和肿瘤抑制基因陆续被发现,各种分子生物学手段也不断发展和改进,基因治疗已成为治疗肿瘤的热点。大多数人类肿瘤中,端粒酶多处于激活状态,其激活态与癌细胞生长关系密切。转基因端粒酶逆转录酶催化亚基(TERT)是端粒酶的核心成分,Pin X1(PIN2/TRF1相互作用端粒酶抑制剂1)是一种内源性端粒酶抑制剂基因,通过与TERT基因直接结合,产生抑制端粒酶活性的生物性效应。本研究目的:通过分析Pin X1在黑色素瘤组织、癌旁组织和正常组织中的表达情况,探讨Pin X1与黑色素瘤不同临床特征之间的关系。同时,通过调节Pin X1的表达,研究Pin X1对血管生成、黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响并初步探讨其相关机制。方法应用免疫组织化学技术分析208例人黑色素瘤组织微阵列(TMA)中Pin X1的表达与黑色素瘤组织的病理分级与临床分期之间的关系。构建Pin X1-si RNA干扰质粒,转染A375和MV3黑色素瘤细胞,Western Blot实验检测其在两种黑色素瘤细胞中的干扰效应。血管形成实验观察沉默Pin X1后的黑色素瘤细胞培养上清液对内皮细胞血管形成能力的影响。CCK8增殖实验检测和Western Blot实验分别观察沉默Pin Xl基因对黑色素瘤细胞增殖能力和细对黑色素瘤细胞迁移和侵袭能力的改变,使用Western Blot法测定Pin Xl、MMP-9和TIMP-1的蛋白表达水平。结果组织芯片(TMA)和免疫组化分析显示:Pin X1表达与患者TNM分期有关。与病理Ⅲ-Ⅳ期组织标本相比,Ⅰ和Ⅱ期标本中的Pin X1染色显著降低(P0.01),Pin X1表达与淋巴结转移显著相关,淋巴结转移阳性组Pin X染色显著降低(P0.01);Western Blot实验表明:与对照组组相比,转染Pin X1-si RNA的A375和MV3两种黑色素瘤细胞中的Pin X1蛋白表达量明显下降;血管形成实验结果显示:以黑色素瘤细胞的培养上清液培养人血管内皮细胞(HUVEC),观察平均管样结构形成数;A375和MV3细胞经沉默Pin X1基因处理后,其血管管样结构形成能力明显升高。与对照组相比,差异有统计学意义(P0.01);CCK8细胞增殖实验结果表明:和对照组相比,沉默Pin X1组的两组细胞在培养24、48、72、96h位点,其增殖效应均明显增强,有非常显著性差异(P0.01)。Western Blot实验结果显示:与对照组相比,转染Pin X1-si RNA后,A375和MV3细胞中Cyclin D1、Cyclin E2和MMP-9表达量显著上升,同时p27、p21和TIMP-1表达量显著下降,均有非常显著性差异(P0.01);细胞迁移和侵袭实验结果表明:沉默Pin X1后,两组细胞迁移和侵袭能均较对照组明显增强,有非常显著性差异(P0.01)。结论Pin X1表达在黑色素瘤中明显下调,其下调程度与黑色素瘤的临床病理分期和淋巴结转移有关。在黑色素瘤细胞中低表达Pin Xl,可通过正性调节细胞周期的进程来增强细胞增殖能力,沉默Pin X1基因还可下调TIMP-1蛋白导致MMP-9通路激活,进而提高黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力。Pin X1基因可能成为黑色素瘤预后判断和靶向治疗的新靶点,有望在针对黑色素瘤发展和转移的诊疗中发挥重要作用。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：

PinX1在黑色素瘤组织中的染色（放大倍数×200）

estern Blot 实验检测 PinX1-siRNA 对黑色素瘤细胞中 PinX1 基因图 2 B PinX1 蛋白表达灰度分析图 （*P < 0.01）PinX1 基因后对血管形成能力的影响在转染 PinX1-siRNA 后细胞血管形成能力是否增强，胞进行实验，小管形成实验结果显示，沉默 PinX1 基因后

BPinX1蛋白表达灰度分析图（*P<0.01）

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本文编号：2824724