甲藻视紫红质基因在哺乳动物细胞中表达系统的构建以及亚细胞定位研究

发布时间：2020-09-25 11:16

　　 浮游植物的生命活动所消耗的能量源自太阳光能,光合作用是浮游植物固定光能的最主要形式。近年来,在包括浮游植物和细菌在内的海洋微型生物中发现的视紫红质被认为是光能捕获蛋白,该蛋白通过捕获光能并能在细胞膜内外形成离子梯度进而合成ATP,即无需通过光合系统I和光合系统II也可将光能转化为化学能,被认为是能够独立于光合系统之外的能量转化蛋白。视紫红质分布于许多微生物门类中,包括古菌、细菌、真菌和藻类,是一种光驱动型跨膜蛋白。根据其功能的不同,视紫红质可以划分为质子泵型视紫红质和离子泵型视紫红质,阳离子通道以及光感受器。根据基因序列比对甲藻中亦发现存在视紫红质基因,且根据氨基酸序列比对很可能属于光驱动质子泵型视紫红质。现已有研究发现东海原甲藻Prorocentrum dongaiense的视紫红质的表达有很强的昼夜周期节律性,光周期表达水平较高,暗周期表达水平较低。异养型甲藻海洋尖尾藻Oxyrrhis marina饥饿处理时质子泵型视紫红质在有光照条件下的表达量高于黑暗条件,与其种群生长率相对应,初步证实这个蛋白可作为能量补充机制。但对甲藻视紫红质更为深入的研究尚待开展,至今还没有直接证据表明甲藻中的视紫红质蛋白的具体功能与作用机制,和其在细胞中的具体表达位置。本研究以课题组已知序列的东海原甲藻以及链状亚历山大藻Alexandrium catenella(原种名:Alexandrium fundyense)的视紫红质基因为目标基因,构建了能够表达这两种甲藻视紫红质基因的哺乳动物细胞表达系统,并在此系统中对东海原甲藻和链状亚历山大藻视紫红质进行了亚细胞定位。主要研究结果如下:(1)论文将东海原甲藻和链状亚历山大藻视紫红质基因重组至表达载体PB513B-1,构建了东海原甲藻视紫红质表达载体PB513B-PdRhod和链状亚历山大藻视紫红质表达载体PB513B-AcRhod。利用质粒共转染技术将PB513B-PdRhod与PB513B-AcRhod分别和转座酶表达载体PB200-PA共转染转入人的胚胎肾上皮细胞HEK293T细胞,借助Piggy Bac转座系统,构建了可以表达甲藻基因的哺乳动物细胞表达系统。(2)论文在成功构建表达甲藻基因的哺乳动物细胞表达系统的基础上,利用细胞免疫荧光技术对在哺乳动物细胞表达系统中表达的两种甲藻视紫红质基因进行了亚细胞定位,细胞免疫荧光结果显示东海原甲藻视紫红质蛋白以及链状亚历山大藻视紫红质蛋白在哺乳动物细胞表达系统当中均在细胞膜上表达。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

而质子在类囊体膜内外两侧产生质子梯度，从而推动光合磷酸化作用使得逡逑ＡＴＰ合成酶合成ＡＴＰ，二是在光的作用下，光驱动质子泵型视紫红质能够在膜内逡逑外两侧产生质子梯度从而驱动ＡＴＰ合成酶合成ＡＴＰ（如图１．１）。光驱动型视紫红逡逑质可直接将光能转化为化学能，即ＡＴＰ，这打破了以往人们对于光能只能通过基逡逑于叶绿素的光合作用才能进入海洋生态系统的认识。Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ等［１７］也认为微生逡逑物视紫红质蛋白在海洋浮游群落结构以及海洋碳循环过程中有着重要的意义。逡逑Ｇｕｏ等［２３］对海洋尖尾藻利用转录组及定量ＰＣＲ等手段研究质子泵型的视紫红逡逑质基因的表达发现在饥饿条件下，给予海洋尖尾藻光照时，视紫红质基因的表达逡逑量和细胞的生长率均高于连续黑暗中培养的海洋尖尾藻。由于海洋尖尾藻为异养逡逑型藻，不投喂食物时，视紫红质在光照条件下所固定的能量极有可能是海洋尖尾逡逑藻生命活动所需能量的主要来源。这与光驱动质子泵型视紫红质能够在光照条件逡逑下提高饥饿处理的细菌成活率的结果一致［２４］。Ｓｈｉ等［２０］经研宄发现东海原甲藻逡逑的视紫红质的表达有很强的昼夜周期节律性，光周期表达水平较高，暗周期表达逡逑水平较低，同时，东海原甲藻视紫红质在中等光强下（１００邋ｕＥ／ｍ％１）表达水平逡逑最高，这与赤潮时海水较混浊，光穿透性不强的生态现象一致，由此猜测视紫红逡逑质可能是赤潮发生时东海原甲藻获得能量的重要来源。所以研究甲藻视紫红质蛋逡逑白在甲藻中的表达特性有助于了觯甲藻视紫红质蛋白在海洋生态系统中为光能逡逑固定所做的贡献以及其在海洋环境中的重要作用。逡逑微生物质子泵型视紫红质的功能研宄主要集中在对海洋细菌视紫红质的研逡逑[

本文编号：2826604