LOXL2和SHMT2基因在结直肠癌中临床意义及机制研究以及TIL的分离鉴定

发布时间：2020-09-26 20:00

　　结直肠癌(CRC)是全球第三高发的癌症,其致死率排在所有癌症中的第四。不同分期对结直肠癌预后影响巨大,早期结直肠癌5年生存率为90.1%,淋巴转移患者为69.2%,而远处转移患者5年生存率仅为11.7%。另外,结直肠癌分子发病机制具有强烈的异质性。不同分子机制对CRC患者造成的影响大不相同,这也对治疗和预后产生巨大影响。基于复杂突变模式的新型分子分型对结直肠的治疗将起到至关重要的作用。因此,对不同致病基因的分子机制以及免疫细胞作用的研究就显得尤为关键。本研究分为三个部分进行,前两部分通过课题组前期芯片数据,挖掘出两个对结直肠发生发展及其关键的基因LOXL2和SHMT2。在已经报道的研究中,LOXL2被认为只在肿瘤间质中影响肿瘤发展。然而我们的研究证实,其不仅在间质中发挥作用,在结直肠癌细胞中同样高表达,并影响肿瘤细胞的增殖和转移。SHMT2对肿瘤生长的研究并不多,我们通过RNAseq找到其下游靶基因,通过回补实验验证结果。前两部分对现如今结直肠癌分子治疗提供新的方向,第三部分分离TIL,则是对结直肠癌免疫治疗、个体化治疗提供技术可能。通过互相联系又相对独立三部分研究,本文从新的角度阐明可能影响CRC发生发展的分子机制,并为CRC的靶向治疗提供新的线索。第一部分:LOXL2对结直肠癌的功能及分子机制研究赖氨酰氧化酶2(LOXL2)是赖氨酰氧化酶蛋白家族的成员。LOX家族对于结缔组织的形成是至关重要的,它可以编码胞外铜依赖性胺氧化酶,催化胶原和弹性蛋白交联形成的第一步。许多研究已经揭示了LOXL2在纤维化疾病中的功能。另外多个研究也显示了LOXL2与癌症进展之间的关联。LOXL2在许多类型的癌症中表达上调,并且与不良预后相关。LOXL2也证实与肿瘤转移相关,这主要得益于其在细胞外基质(ECM)催化的胶原蛋白和弹性蛋白共价交联中的主要作用。本部分研究首先使用Realtime-PCR、Western blot等方法对结直肠癌临床标本中LOXL2表达量进行检测,我们发现LOXL2在结直肠癌组织中的表达量明显高于正常肠腺,并且通过免疫组织化学染色证实LOXL2高表达预示着不良预后。紧接着,我们使用shRNA在体外敲减LOXL2,CCK8、克隆形成等实验结果显示肠癌细胞的增殖能力受到明显抑制;同时,划痕实验、Transwell等实验结果显示肠癌细胞的转移能力也显著下降。接着,我们通过使用免疫缺陷小鼠进行体内实验。敲减LOXL2的肠癌细胞在小鼠体内无论是增殖能力还是转移能力都受到明显削弱。最后我们通过荧光素酶报告基因等方法分析LOXL2影响细胞增殖和转移能力的机制,发现敲减LOXL2的细胞,Vimentin表达显著下降。第二部分:SHMT2对结直肠癌的功能及分子机制研究丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)是磷酸吡哆醛(PLP)(维生素B6)依赖性酶,SHMT有两种同工酶,SHMT1和SHMT2,SHMT1主要存在于细胞质而SHMT2存在于线粒体中。SHMT2作为丝氨酸分解代谢与一碳单位交换的桥梁发挥调控作用。丝氨酸驱动的一碳单位代谢被确定为NADPH产生的重要途径。正是基于此,SHMT2被视为肿瘤发生发展过程中非常重要的一个基因,多种肿瘤已被证实与其相关。本部分研究首先使用Realtime-PCR、Western blot等方法对临床标本中SHMT2表达量进行检测,SHMT2在肠癌组织中的表达显著高于正常肠腺,并且通过免疫组织化学染色确定高表达SHMT2的患者预后较差。接着,我们使用shRNA在肠癌细胞中敲减SHMT2,发现细胞的增殖能力受到明显抑制,在体内实验中也得到同样的结果。随后,我们使用RNAseq对敲减SHMT2细胞进行测序分析,找到多个与细胞周期相关的基因表达下调。我们使用慢病毒对排名第一的基因UHRF1进行过表达,在敲减SHMT2的细胞中回补UHRF1,细胞的增殖能力在体内体外实验中均得到回复,但并没有达到起始水平。因此,我们又对RNAseq结果中排名第二的CCND1基因进行回补,最终细胞增殖能力得到完全回复。第三部分肿瘤侵润T淋巴细胞的分离鉴定肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TIL),是离开血液并迁移到肿瘤中的白细胞。肿瘤浸润的免疫细胞的功能可以在整个肿瘤进展过程中动态地改变并且对抗癌治疗作出反应。TIL涉及杀死肿瘤细胞,肿瘤中淋巴细胞的存在通常与更好的临床结果相关。TIL存在是指在肿瘤细胞之间发现淋巴细胞,CD3已被用于检测肿瘤样品中的淋巴细胞。在结直肠癌中,肿瘤浸润淋巴细胞与微卫星不稳定性癌症有关。同时,对消化道肿瘤进行检查点抑制剂治疗时,也需要与TIL结合使用。TIL作为过继性细胞转移疗法治疗癌症的过程由美国国家癌症研究所的Steven Rosenberg博士首先提出。自体淋巴细胞是从患者的肿瘤中分离出来的,并在体外进行大量的扩增培养。本部分研究通过直接分离切除结直肠癌组织及其配对正常肠腺组织中的淋巴细胞,对已发表研究中的方法进行改良,来对TIL进行培养并鉴定,从而建立系统的TIL分离鉴定扩增方法。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.3
【部分图文】：

表达水平,肠腺

图 1-1 LOXL2 mRNA 的表达水平在 CRC 中上调Figure 1-1 LOXL2 mRNA expression levels were up-regulated in CRCA. mRNA 芯片数据显示，在 8 对结直肠癌组织中 LOXL2 表达高于正常肠腺。B. Realtime-PCR 分析显示 40 对肠癌组织 LOXL2 表达高于正常肠腺。****P < 0.0001。A. mRNA microarray shows upregulation of LOXL2 in 8 pairs of CRC tissues compared withnormal colorectal mucosa. B. Realtime-PCR for LOXL2 expression in 40 paired CRC tumor tissuesand corresponding normal mucosa. ****P < 0.0001.我们以前的工作中 LOXL2 在 mRNA 芯片中鉴定为上调基因[35]（P<0.0001;图1-1A）。因此，在本研究中，我们首先验证了芯片结果。使用 Realtime PCR 检测 40对配对结直肠癌组织和邻近正常肠腺组织中 LOXL2 mRNA 的表达水平。我们发现，与正常组织相比，CRC 组织中 LOXL2mRNA 表达显着升高（P<0.0001;图 1-1B）。我们还对 7 对配对的 CRC 组织和相邻的正常组织进行了 western 印迹分析，发现与正常肠腺组织相比，CRC 组织中的 LOXL2 蛋白水平升高（图 1-2A）。我们接下来在 228 个 CRC 组织和相邻的正常肠腺组织中进行了免疫组织化学分析。代表性的图像如图 1-2B 所示。在正常肠腺组织的上皮细胞中检测到低LOXL2 表达（图 1-2B-a），而在肿瘤组织的上皮细胞中发现低或高 LOXL2 表达

粘膜,并提,样本,低水平

- 26 -图 1-2 LOXL2 蛋白的表达水平在 CRC 中上调，并提示不良预后Figure 1-2 LOXL2 protein expression levels were up-regulated in CRC and indicated poorprognosisA. 7 对 CRC 样本（C1-7）中的 LOXL2 蛋白的 Western 印迹分析与正常结直肠粘膜（N1-7）的比较。β-ACTIN 用作内参。 B. CRC 样本和正常粘膜组织中 LOXL2 的免疫组织化学分析。（a）在 CRC 细胞中 LOXL2 低水平表达（b，c）在 CRC 细胞中 LOXL2 低水平和高水平表达（d）在肿瘤侵袭边缘区域中 CRC 细胞中表达 LOXL2。放大倍数，200×。比例尺表示 50 微米。C. LOXL2 表达水平决定了 CRC 患者总体生存的 Kaplan-Meier 图。统计显着性通过 Log-rank 测试计算。P=0.026.A. Western blot analysis of LOXL2 protein in 7 CRC samples (C1 7) compared with normalcolorectal mucosa (N1 7). β-ACTIN was for control. B. Immunohistochemical analysis ofLOXL2 in CRC samples and normal mucosa tissues. Representative images of normal mucosatissues (a), low-level expression of LOXL2 in CRC cells (b), high-level expression of LOXL2 inCRC cells (c), and LOXL2 expression in CRC cells in the invasive marginal region (d).Magnification, 200×. Scale bar indicates 50 μm. C. LOXL2 expression determined Kaplan Meier

细胞系,内参,病毒,转染

- 30 -图 1-3 在 CRC 细胞系中 LOXL2 的表达及敲减稳系的建立。Figure 1-3 LOXL2 expression in CRC cell lines and establishment of knockdown stable lines.A. 6 种 CRC 细胞系中 LOXL2 mRNA 水平的 qPCR 分析。β-ACTIN 用作内参。B. 6 种 CRC细胞系中 LOXL2 蛋白水平的免疫印迹分析。 β-ACTIN 用作内参。 C, D qPCR 分析在DOX 存在和不存在下用 shLOXL2-TET-ON 病毒转染的 HCT116（C）和 DLD1（D）细胞系中 LOXL2 表达水平。E 在 DOX 存在和不存在下用 shLOXL2-TET-ON 病毒转染的 HCT116（C）和 DLD1（D）细胞系中 LOXL2 蛋白水平的 WB。**P<0.01, ***P<0.001。A Realtime PCR analysis of LOXL2 mRNA levels in 6 CRC cell lines. β-ACTIN mRNA was usedas an internal control. B Immunoblot analysis of LOXL2 protein level in six CRC cell lines. β-

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