Cytophaga hutchinsonii表面纤维素酶系的作用及chu_hypZ1基因功能研究

发布时间：2020-09-28 13:10

　　随着石油等不可再生资源的消耗殆尽,迫使人们将目光投向其他可再生资源的开发利用。纤维素是地球上最丰富的可再生资源,如何将其转化为可直接使用的能源是人类解决能源危机的重要途径之一。Cytophaga hutchinsonii是一种能够高效地降解结晶纤维素的革兰氏阴性细菌,它的降解机制与其他纤维素降解微生物不同。通过分析Chutchinsoni.的基因组序列,发现它有9个纤维素内切酶,其中5个位于细胞表面,本文通过基因敲除的方法,在表面纤维素酶四敲菌株CH581的基础上继续敲除Ce19D,研究了表面纤维素酶在Chutchinson.降解纤维素的过程中所起的作用。同时,利用转座子插入突变的方法筛选到一个影响纤维素降解的关键基因,并对其功能进行了研究。具体研究内容及结果如下:1.C hutchinsonii中位于细胞表面的纤维素酶的作用研究Chutchinson.中5个位于细胞表面的内切纤维素酶分别是Ce15A、Ce19A、Ce19B、Ce19D和Ce19E。2016年,朱永涛等构建了C.hutchinsonii表面内切酶四敲菌株,将Ce15A、Ce19A、Ce19B以及Ce19E全部敲除,只剩Ce19D未能敲除,此菌株(CH581)能够利用纤维素作为碳源生长。我们在此基础上,成功将定位于细胞表面的最后一个内切纤维素酶Ce19D敲除,并将此菌株命名为CH681。发现Ce19D敲除后,突变株CH681能够利用纤维素作为碳源生长,但是在滤纸平板上的降解圈要明显小于野生型。在液体中的生长曲线分析发现其在葡萄糖和纤维二糖中的生物量不能达到野生型的水平,但对底物利用没有延迟,而在再生无定型纤维素(Regenetated amorphous cellulose,RAC)和微晶纤维素Avicel中生长明显延迟,说明其底物利用速率减慢,这一点从纤维素粉的底物利用速率上也可以看出来。同时我们在检测细胞表面的内切酶酶活时发现,表面内切纤维素酶缺失后酶活明显降低,说明敲除的这几个酶是表面酶活的主要来源。但是表面仍有部分酶活存在,这剩余的酶活是如何如产生的?通过分析我们发现了四个预测定位于细胞表面的糖苷酶,分别是bglE、bglF、bglG和bglI,糖苷酶的底物具有非专一性,是否是由于它们的存在而导致了剩余酶活的存在。因此,我们首先通过qPCR检测了突变株与野生型中这几个糖苷酶基因的转录水平的变化,发现它们的转录水平有不同程度的提高,特别是bglI差异倍数最为明显,提高了 9倍左右。因此,我们分别设计这几个糖苷酶的单敲除和CH681基础上的连续敲除,检测这几个糖苷酶在纤维素降解过程中是否发挥了作用。首先,将它们分别单敲除以后发现每个突变株的滤纸降解能力并没有明显的变化,说明某一个糖苷酶的缺失并不会对纤维素降解产生影响,而循环敲除工作还剩bglG未进行敲除,初步对CH685菌株(CH681基础上敲除bglE、bglF、bglH和bglI)的表型验证发现,其滤纸降解速率减慢,通过酶活测定发现,其内切酶酶活与CH681菌株相比有所降低。说明细胞表面糖苷酶的缺失对滤纸降解以及酶活也有部分影响但并不是主要的。2.基因chu_hypZ1的功能研究本部分通过转座子插入突变的方法筛选到一株不能在滤纸平板上生长的菌株,定位插入位点是一个未知功能基因,我们将它定义为chu_hypZ1。敲除chu_hypZ1后获得突变株△hypZ1,它不能够利用纤维素,通过基因回补,能够使其表型恢复,说明表型缺陷是由chu_hypZ1的缺失所致。RT-PCR显示△hypZ1中chu_hypZ1的邻近基因的转录未受到chu_hypZ1敲除的影响。CHU_hypZ1的功能未知,Blast P比对发现与其相似的蛋白均为未知功能蛋白,且其中有些属于噬纤维菌属,说明了此蛋白在进化中的保守性。突变株△hypZ1可以在葡萄糖、纤维二糖和RAC中生长,但是在微晶纤维素Avicel中明显出现生长缺陷,说明chu_hypZ1的缺失影响了 C.hutchinsonii对纤维素结晶区的降解。通过检测Avicel结晶度的变化也进一步证实了chu_hypZ1是一个与结晶区降解相关的基因。突变株△hypZ1的细胞表面内切酶酶活明显降低,通过我们的研究发现这一方面是由这些内切酶的转录水平降低所致,另一方面位于细胞表面的内切酶不能正常定位于外膜也是原因之一。此外,突变株的外膜蛋白以及外膜吸附蛋白与野生型相比缺失了几个条带,经过鉴定其中多为未知功能蛋白,另外有两个属于Ⅸ型分泌系统的组分蛋白,是否chu_hypZ1的缺失对Ⅸ型分泌系统产生了影响?通过检测Ⅸ型分泌系统的底物蛋白质CHU_0344,发现CHU_0344的条带可以在突变株的胞外检测到,说明chu_hypZ1的缺失对Ⅸ型分泌系统并没有产生影响。通过鉴定胞外的差异蛋白,发现原本属于膜上的蛋白却能够在胞外检测到,例如Ce15A以及Bg1F,Ce15A是一个内切酶,而Bg1F正是外膜上缺失的那个蛋白。因此,我们推测可能chuhypZ1的缺失,导致了一些膜蛋白不能正常锚定于膜上,使得纤维素降解缺陷。本文首先以Chutchinson.独特的纤维素酶系分布为切入点,发现尽管细胞表面有多个纤维素酶和糖苷酶,但它们对纤维素的降解并不是必需的,只能减缓对纤维素的利用。推测它们可能只是起到了松解无定形区,产生寡糖链的作用。同时,筛选到一个影响纤维素降解的关键基因chuhypZ1,发现它的缺失导致一些膜蛋白不能正常锚定于细胞膜上而导致降解缺陷。本文对Chutchinson.表面纤维素酶系以及chu_hypZ1的功能研究,使我们对C.hutchinsonii的纤维素降解机制有了进一步的了解,为实现纤维素资源的高效利用提供了理论基础。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q93;O636.11
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写词表
第一章研究背景
    1.1 纤维素资源的开发利用
    1.2 纤维素的结构
    1.3 纤维素的微生物降解
        1.3.1 纤维素降解微生物
        1.3.2 微生物的纤维素降解机制
    1.4 纤维素结晶区的降解策略
        1.4.1 CBM的作用及分类
        1.4.2 Expansins以Expansin-like proteins
        1.4.3 裂解多糖单加氧酶(LPMOs)
    1.5 Cytophaga hutchinsonii研究背景
        1.5.1 C.hutchinsonii的系统发育
        1.5.2 C. hutchinsonii的特征
        1.5.3 C.hutchinsonii的研究进展
        1.5.4 C.hutchinsonii独特的纤维素酶系
    1.6 论文的立题和工作思路
第二章 C.hutchinsonii表面纤维素酶系的作用
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌种及质粒
        2.1.2 实验中用到的引物
        2.1.3 主要试剂及仪器
        2.1.4 培养基和缓冲液
        2.1.5 分子生物学所用反应体系及操作
        2.1.6 E.coli感受态细胞的制备与热激转化
        2.1.7 C.hutchinsonii感受态细胞的制备及电击转化
        2.1.8 基因敲除
        2.1.9 滤纸降解实验
        2.1.10 生长曲线测定
        2.1.11 RT-PCR
        2.1.12 RT-qPCR
        2.1.13 纤维素酶活测定
    2.2 实验结果
        2.2.1 表面纤维素酶缺失后菌体能够利用纤维素
        2.2.2 生长曲线
        2.2.3 表面纤维素酶缺失株的酶活
        2.2.4 表面糖苷酶的缺失不影响对纤维素的降解
        2.2.5 表面糖苷酶的转录水平
        2.2.6 CH681基础上敲除糖苷酶后的表型
    2.3 讨论
第三章 chu_hypZ1基因功能研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌种及质粒
        3.1.2 实验中用到的引物
        3.1.3 主要试剂及仪器
        3.1.4 培养基和缓冲液
        3.1.5 分子生物学常用反应体系及操作
        3.1.6 纤维素降解缺陷株的筛选
        3.1.7 基因敲除
        3.1.8 基因回补与过表达
        3.1.9 再生无定形纤维素(RAC)的制备
        3.1.10 XRD测定纤维素结晶度
        3.1.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
        3.1.12 C. hutchinsonii各组分蛋白样品的制备(操作均在4℃下进行)
    3.2 结果
        3.2.1 滤纸降解缺陷株的获得
        3.2.2 生物信息学分析
        3.2.3 chu_atoS与纤维素降解无关
        3.2.4 chu_hypZ1是纤维素结晶区降解相关基因
        3.2.5 CHU_hypZ1与纤维素结合无关
        3.2.6 chu_hypZ1对纤维素酶酶活的影响
        3.2.7 差异蛋白的鉴定
    3.3 讨论
全文总结及展望
参考文献
在读期间发表的学术论文
致谢
学位论文评阅及答辩情况表

【相似文献】