CRP基因沉默对H9c2心肌细胞和大鼠心肌缺血模型中miR-21及其靶基因表达的调控作用
发布时间：2020-09-28 11:59
心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是缺血性心脏病中最为严重的疾病之一。C反应蛋白(C reactive protein,CRP)是一类急性反应蛋白,是心血管疾病中重要的炎症标记物,但其在心血管疾病进程中的作用尚属未知。本研究拟通过在H9c2心肌细胞和大鼠心肌缺血模型中沉默CRP基因,通过体外和体内实验探索CRP基因是否调控心肌缺血过程中的重要因子miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1,了解缺血过程中心肌损伤的全新的分子机理。体外实验:设计并构建三组特异性沉默CRP基因的慢病毒载体和一组无敲减作用的对照组慢病毒载体,筛选出沉默CRP基因效率最佳的慢病毒载体。通过MTT实验分析CRP沉默组和对照组中H9c2心肌细胞的活性,并以实时定量PCR检测CRP基因沉默后H9c2心肌细胞中miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达情况。体内实验:随机选取野生型与CRP敲除型雄性SD大鼠各8只,分别设为假手术组和手术组(每组4只)。通过结扎左前降支冠状动脉建立心肌缺血模型,缺血50 h后收集心脏组织并制作冰冻切片,根据病理染色后心肌细胞形态的完整性区分并捕获假手组、手术组正常区和缺血区的心肌细胞,采用实时定量PCR检测大鼠不同组别中各区域的miR-21及其靶基因PDCD4、PTEN和Spry1 mRNA表达情况。MTT实验结果表明CRP沉默后H9c2心肌细胞活性(0.78±0.030)显著高于对照组(0.66±0.010,P0.05)。同时,CRP沉默后miR-21的水平显著上调并高于对照组(P0.01),相应的靶基因PDCD4、PTEN和Spry1的表达水平相应下调并显著低于对照组(P值均小于0.001)。在动物实验中,CRP敲除后假手术组大鼠的正常心肌细胞中miR-21水平显著高于野生型假手术组(P0.05),其所抑制的靶基因PDCD4、PTEN和Spry1表达水平相应地低于野生型假手术组,与体外实验结果一致。在心肌缺血模型中,与相应的假手术组相比,野生型和CRP敲除型手术组缺血区的miR-21表达水平均上调,但CRP敲除后手术组缺血区miR-21水平由于基线较高,上调的幅度低于野生型大鼠。相应地,CRP敲除可以增加miR-21下游基因PDCD4和PTEN在假手术组和手术组缺血心肌中的表达差异。本研究通过体外和体内实验一致证明了CRP可以调控心血管疾病进程中的重要因子miR-21及其下游靶基因的表达。在大鼠心肌缺血模型中研究CRP敲除对miR-21及其靶基因的调控方式,推测CRP敲除对缺血心肌具有与缺血预适应相似的保护作用,提示CRP可能是开发新型药物治疗缺血性心血管病的潜在作用靶点。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R54
【部分图文】：
1-1 miR-21 及其靶基因在心肌梗死过程中的重要调控作意义和内容目的是通过体外和体内实验探索 CRP 是否通过调控心1 及其靶基因 PDCD4、PTEN 和 Spry1 来影响心肌缺血体外实验中，研究 CRP 基因沉默对 H9c2 大鼠心肌细PTEN 和 Spry1 mRNA 的调控作用，以及对细胞增殖能，研究 CRP 基因敲除是否调控大鼠缺血心肌细胞中 mPTEN 和 Spry1 mRNA 的表达，结合本实验室前期的表iR-21 及其靶基因的调控影响心肌缺血和心肌梗死的病血管疾病中致死率最高的疾病之一，在心肌梗死过程中
助包装质粒共转染 293T 细胞，在细胞中完成慢病毒的包装，离心浓缩收集高滴度的病毒颗粒。包装好的慢病毒颗粒可以直接用于宿主细胞的转染，在细胞质中被其自身携带的逆转录酶逆转为 DNA，形成 DNA 整合前复合体，进入细胞核后，DNA 整合到宿主细胞基因组中。整合后的 DNA 可以转录成 siRNA 前体，再运输到细胞质中，被酶剪切形成 siRNA，产生 RNA 干扰以沉默相应的目的基因。本实验所用的 shRNA 干扰慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成，如图 2-1 所示。细菌质粒序列含有一个 Ampicillin 抗性基因和一个高拷贝复制子 pUCori。慢病毒基因组序列是从元件 5’LTR 开始，到 3’LTR 结束。慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子：一个是目的基因表达盒子，另外一个是 marker 基因 EGFP 表达盒子。Marker 基因 EGFP 表达盒子已经克隆在载体上，无需重新构建。目的基因表达盒子则包括三部分序列：U6 启动子、CRP shRNA 和终止子。U6 启动子已经克隆在载体上，构建载体只需通过 annealing-ligation 技术将 CRP 基因的 shRNA 和终止子克隆到载体上即可。
华南理工大学硕士学位论文0 进行统计学分析，所有比较采用 t 检验，统计学显著泳鉴定结果达载体质粒为 pLV.shRNA.P/E基片段后，获得的目的片段大2-2），结果显示目的片段的位
本文编号：2828761
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R54
【部分图文】：
1-1 miR-21 及其靶基因在心肌梗死过程中的重要调控作意义和内容目的是通过体外和体内实验探索 CRP 是否通过调控心1 及其靶基因 PDCD4、PTEN 和 Spry1 来影响心肌缺血体外实验中，研究 CRP 基因沉默对 H9c2 大鼠心肌细PTEN 和 Spry1 mRNA 的调控作用，以及对细胞增殖能，研究 CRP 基因敲除是否调控大鼠缺血心肌细胞中 mPTEN 和 Spry1 mRNA 的表达，结合本实验室前期的表iR-21 及其靶基因的调控影响心肌缺血和心肌梗死的病血管疾病中致死率最高的疾病之一，在心肌梗死过程中
助包装质粒共转染 293T 细胞，在细胞中完成慢病毒的包装，离心浓缩收集高滴度的病毒颗粒。包装好的慢病毒颗粒可以直接用于宿主细胞的转染，在细胞质中被其自身携带的逆转录酶逆转为 DNA，形成 DNA 整合前复合体，进入细胞核后，DNA 整合到宿主细胞基因组中。整合后的 DNA 可以转录成 siRNA 前体，再运输到细胞质中，被酶剪切形成 siRNA，产生 RNA 干扰以沉默相应的目的基因。本实验所用的 shRNA 干扰慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成，如图 2-1 所示。细菌质粒序列含有一个 Ampicillin 抗性基因和一个高拷贝复制子 pUCori。慢病毒基因组序列是从元件 5’LTR 开始，到 3’LTR 结束。慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子：一个是目的基因表达盒子，另外一个是 marker 基因 EGFP 表达盒子。Marker 基因 EGFP 表达盒子已经克隆在载体上，无需重新构建。目的基因表达盒子则包括三部分序列：U6 启动子、CRP shRNA 和终止子。U6 启动子已经克隆在载体上，构建载体只需通过 annealing-ligation 技术将 CRP 基因的 shRNA 和终止子克隆到载体上即可。
华南理工大学硕士学位论文0 进行统计学分析，所有比较采用 t 检验，统计学显著泳鉴定结果达载体质粒为 pLV.shRNA.P/E基片段后，获得的目的片段大2-2），结果显示目的片段的位
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 刘宇;杨娟;韦婷;罗煜;孟宪丽;曾勇;;改良冠脉结扎法大鼠心肌缺血模型的制备[J];中药药理与临床;2015年06期
2 徐铭;;大鼠心肌梗死模型制作的影响因素[J];上海畜牧兽医通讯;2012年02期
本文编号：2828761
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2828761.html
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