死鸭胚中大肠杆菌的耐药与毒力基因分子流行病学调查

发布时间：2020-09-28 11:47

　　大肠杆菌是一种重要的食源性致病菌,具有广泛的宿主性,可导致人畜共患病,其成为危害养殖业发展最为严重的病原菌之一,尤其是大肠杆菌在种蛋孵化过程中能引起鸭胚的死亡,而且容易造成大面积感染,对养鸭业造成了严重的危害。本论文为研究死亡鸭胚中病原菌的感染状况,以探究鸭胚在孵化过程中的死亡原因;通过药敏试验和耐药基因检测,初步掌握鸭胚源大肠杆菌耐药及耐药基因的携带情况;通过对鸭胚源大肠杆菌携带毒力基因的检测及ETT2毒力岛类型的分析,探讨鸭胚源大肠杆菌的致病性。本研究共分五部分。(1)死亡鸭胚中细菌的分离鉴定通过对无破损的死亡鸭胚进行细菌分离培养、染色镜检、16SrDNA鉴定等方法,从415枚鸭胚中共分得细菌370株,分属27个种,其中324枚存在细菌感染,感染率为78.1%。在分离的所有细菌中,大肠杆菌和沙门氏菌分别占33.2%和25.4%,是死亡鸭胚中的主要菌群。结果表明,造成种鸭孵化场胚胎死亡率和弱雏率明显升高的主要原因是细菌感染所致,并且大肠杆菌是主要的致病菌之一。(2)鸭胚源大肠杆菌的耐药性调查采用世界卫生组织(WHO)推荐的纸片法(Kirby-Baure法)对123株鸭胚源大肠杆菌进行18种抗生素(氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物、β-内酰胺类药物等)的耐药性检测。结果显示,123株大肠杆菌对18种抗生素表现出不同程度的耐药:β-内酰胺类药物的耐药性最高,头孢氨苄耐药率为82.9%,氨苄西林的耐药率为77.2%,头孢噻吩耐药率72.4%;喹诺酮类药物耐药率较高,环丙沙星为54.5%,诺氟沙星耐药率为49.6%,左氧氟沙星耐药率为48%;氨基糖苷类药物耐药率较低,其中链霉素的耐药率最高为39.0%,其次是卡那霉素为30.9%,最低为庆大霉素,耐药率为10.6%;其他类药物中耐药率最低的为多粘菌素B,耐药率为13.8%。该项研究调查表明,在治疗和预防泰安地区种鸭孵化场致病性细菌感染时可以选择性配合使用氨基糖苷类药物和多粘菌素B。(3)鸭胚源大肠杆菌耐药基因的检测与鉴定对鉴定的123株鸭胚源大肠杆菌进行氨基糖苷类钝化酶基因三重PCR检测,结果显示123株大肠杆菌中耐药基因ant(3’’)-Ia、aac(6’)-Ib和aph(3’)-IIa携带率分别为22.8%、3.3%和2.4%。16S甲基化酶基因的PCR检测结果显示,123株鸭胚源大肠杆菌中耐药基因armA、rmt A和rmtB的携带率分别为95.1%、19.5%和0.8%。喹诺酮类耐药基因PCR检测结果表明,qnrD、qnrS、oqxA和oqxB的携带率分别为11.4%、22.0%、22.0%和15.4%,而qnrA、qnrB和qnrC未检出。β-内酰胺类耐药基因PCR检测结果显示,123株大肠杆菌中50株携带有TEM型β-内酰胺酶类耐药基因,基因携带率40.7%。(4)鸭胚源大肠杆菌毒力基因的检测与鉴定对123株鸭胚源大肠杆菌进行了18种毒力基因的多重PCR检测,分离强毒株42株,占比34.1%。其中yijp、fimC、iss、ibeB、ompA五种基因有非常高的检出率,此项调查为禽致病性大肠杆菌的长期监测和研究提供了理论依据。本研究对123株鸭胚源大肠杆菌进行了ETT2毒力岛的PCR检测,结果显示其中100株携带有ETT2毒力岛,检出率为81.3%。123株鸭胚源大肠杆菌的ETT2毒力岛共分为A~K 11个类型,其中包括1个完整型和10个不同程度的缺失型。其中B型和C型的ETT2毒力岛检出率最高,检出率分别为31.7%(39株)和26.8%(33株)。此项试验对ETT2毒力岛在鸭胚源大肠杆菌的分布情况进行调查,为进一步研究ETT2毒力岛在鸭胚源大肠杆菌中的致病机制奠定基础。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.612
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 大肠杆菌
        1.1.1 大肠杆菌病
        1.1.2 病原特性
    1.2 大肠杆菌的检测方法
        1.2.1 免疫学检测技术
        1.2.2 分子生物学检测技术
        1.2.3 死活菌检测技术
        1.2.4 其他新型检测技术
    1.3 大肠杆菌的耐药性
        1.3.1 细菌的耐药机制
        1.3.2 大肠杆菌的耐药现状
    1.4 大肠杆菌毒力因子
        1.4.1 黏附素
        1.4.2 铁摄取系统
        1.4.3 保护素
        1.4.4 侵袭素IbeA
        1.4.5 毒素
    1.5 毒力岛
        1.5.1 毒力岛的特征
        1.5.2 毒力岛的结构特点
        1.5.3 大肠杆菌中的毒力岛
    1.6 本研究的目的意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 病料来源
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 分子生物学试剂
        2.1.4 实验仪器设备
        2.1.5 引物合成
    2.2 方法
        2.2.1 死亡鸭胚中细菌的分离鉴定
        2.2.2 鸭源大肠杆菌药敏试验
        2.2.3 鸭源大肠杆菌耐药基因的检测与鉴定
        2.2.4 鸭源大肠杆菌毒力基因检测与鉴定
        2.2.5 鸭源大肠杆菌ETT2毒力岛类型分析
3 结果
    3.1 死亡鸭胚中细菌的分离鉴定结果
        3.1.1 革兰氏染色结果
        3.1.2 16SrDNA基因PCR扩增产物电泳结果
        3.1.3 16SrDNA测序结果
        3.1.4 大肠杆菌在麦康凯培养基培养特性
    3.2 鸭胚源大肠杆菌药敏试验结果
        3.2.1 部分细菌药敏试验生长状况
        3.2.2 鸭胚源大肠杆菌药敏试验统计结果
    3.3 鸭胚源大肠杆菌耐药基因检测与鉴定结果
        3.3.1 耐药基因PCR扩增产物电泳结果
        3.3.2 氨基糖苷类钝化酶基因检测与鉴定结果
        3.3.3 16S甲基化酶基因检测与鉴定结果
        3.3.4 喹诺酮类耐药基因检测与鉴定结果
        3.3.5 β-内酰胺类耐药基因检测与鉴定结果
        3.3.6 β-内酰胺类耐药基因检测与鉴定结果
    3.4 鸭源大肠杆菌毒力基因检测与鉴定结果
        3.4.1 毒力基因PCR扩增产物电泳结果
        3.4.2 毒力基因检测与鉴定统计结果
        3.4.3 强毒株毒力基因统计结果
    3.5 鸭源大肠杆菌ETT2毒力岛类型分析结果
        3.5.1 ETT2毒力岛PCR扩增产物部分电泳结果
        3.5.2 ETT2毒力岛类型统计结果
4 讨论
    4.1 死亡鸭胚中细菌的流行状况
    4.2 鸭胚源大肠杆菌药敏试验检测
    4.3 鸭源大肠杆菌耐药基因检测
    4.4 鸭源大肠杆菌毒力基因检测
    4.5 鸭源大肠杆菌ETT2毒力岛类型分析
5 结论
参考文献
致谢

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