九孔鲍MSTN、BMP-2基因克

发布时间：2020-09-29 09:29

　　九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)是中国南方沿海具有较高经济价值的海水养殖贝类,20世纪90年代中后期以来,开始爆发疾病导致九孔鲍大规模死亡,给九孔鲍产业造成严重的经济损失,限制了我国九孔鲍产业的发展。种质退化是九孔鲍病害爆发和死亡的主要原因,通过遗传改良选育出抗性强,培育出生长快的品种是解决九孔鲍病害爆发和死亡的主要途径。在分子水平研究生长相关基因的分子调控机制并筛选与生长性状相关的分子标记,有助于培育出抗性强、生长快的九孔鲍品种。转化生长因子超家族(transforming growth factor type beta,TGF-β)是一组具有结构相关性的多功能分泌型细胞因子,参与细胞增殖、分化和生长等多种生物学过程。肌肉生长抑制素(MSTN)是转化生长因子β超家族(TGF-β)中参与动物肌肉生长的重要调控因子,是经济动物遗传改良的重要候选基因;骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子超家族(TGF-β)中最大的分泌型信号传导分子,在动物的骨骼发育及器官形成中具有重要作用,BMP-2基因是BMP家族的重要成员,在信号传递、贝壳形成过程中具有重要作用。为探究MSTN、BMP-2基因在九孔鲍中的功能,克隆九孔鲍MSTN、BMP-2基因cDNA全长,利用生物信息学分析了基因序列和氨基酸特征,并运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检了MSTN、BMP-2基因在各组织和发育时期的表达水平。为探究九孔鲍MSTN、BMP-2基因的多态性及生长相关性,采用PCR产物直接测序的方法对九孔鲍MSTN、BMP-2基因进行SNP筛选,并通过基因多态性与九孔鲍体质量、壳长、壳宽进行关联分析,运用qRT-PCR技术检测了MSTN基因不同基因型九孔鲍的表达水平。为九孔鲍生长相关分子机制的研究、生长标记的开发和标记辅助选择育种提供参考。主要研究结果如下:1、九孔鲍MSTN基因cDNA克隆及表达采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从九孔鲍右侧壳肌中获得了MSTN基因cDNA全长3755 bp,其中5′非编码区(5′UTR)324 bp,3′非编码区(3′UTR)1985 bp,开放阅读框(ORF)1446 bp,编码481个氨基酸,分子质量为54.96 ku,理论等电点pI:9.41;具有N端信号肽(1-17aa)、TGF-β前肽区域(157-367aa)和成熟肽区域(379-481aa),以及蛋白酶水解位点RRPR(364-368 aa)和C末端生物活性区9个保守的半胱氨酸残基,符合TGF-β超家族蛋白典型结构特征,且预测到2个新的蛋白酶水解位点RQRR(120-124 aa)、RYRR(235-239 aa)。系统进化树结果显示九孔鲍MSTN基因和红鲍MSTN基因聚为一支。qRT-PCR结果表明,九孔鲍MSTN基因在检测的6个组织均表达且在足、右侧壳肌、外套膜中高表达,在鳃、性腺、肝脏中低表达;在检测的7个发育时期均表达且在受精卵、原肠胚、稚鲍时期高表达,在卵、4细胞、8细胞时期、幼鲍时期表达量较低。研究表明MSTN基因可能在九孔鲍肌肉生长中具有重要作用。2、九孔鲍BMP-2基因cDNA克隆及表达采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从九孔鲍外套膜中获得了BMP-2基因cDNA全长2572 bp,其中5′非编码区(5′UTR)123 bp,3′非编码区(3′UTR)1150 bp,开放阅读框(ORF)为1299 bp,编码432个氨基酸,其分子质量为48.59 ku,理论等电点(pI)为9.84;具有N端信号肽(1-39 aa)、TGF-β前肽区域(63-294 aa)和TGF-β成熟肽区域(331-432 aa),以及蛋白酶水解位点RLRR(272-275 aa)和7个保守的半胱氨酸残基,符合TGF-β超家族蛋白典型结构特征。系统进化树结果显示九孔鲍BMP-2基因和耳鲍聚为一支。qRT-PCR结果表明,BMP-2基因在九孔鲍的6个组织中均有表达,在足、右侧壳肌、外套膜及肝脏中显著高表达;在检测的7个发育时期均表达,其中在受精卵、4细胞、8细胞、原肠胚、稚鲍时期表达量显著高于卵、幼鲍时期。研究表明BMP-2基因可能在九孔鲍贝壳形成中具有重要作用。3、九孔鲍MSTN基因多态性及与生长性状关联分析实验采用PCR产物直接测序的方法在九孔鲍MSTN基因中,共筛选出了9个SNP位点,5′非编码区(5′UTR)1个SNP位点为g252GA;开放阅读框(ORF)4个SNP位点为g414AC、g558CA、g909CT和g960AT;3′非编码区(3′UTR)4个SNP位点为g2148GA、g2164AG、g2420CG和g2520CG,9个SNP位点均检测到3种基因型。其中开放阅读框中的4个SNP位点突变均不改变所编码的氨基酸,为同义突变,九孔鲍MSTN基因9个SNP位点的期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)分别在0.2155-0.4778和0.2195-0.4471间,多态信息含量(PIC)的范围为0.1913-0.3621,除g2164AG为低度多态性外,其余均为中度多态性。哈迪-温伯格平衡(HWE)检验结果表明,除g2420CG位点外,其余8个SNP位点均符合哈迪-温伯格平衡。SNP位点与生长性状关联分析结果显示九孔鲍MSTN基因编码区SNP位点g909CT发生C/T同义突变,与九孔鲍体质量、壳长、壳宽显著相关,TT基因型九孔鲍的体质量显著高于CC基因型和TC基因型的个体,TT基因型的壳长、壳宽显著高于CC基因型(P0.05)。qRT-PCR检测结果表明,在九孔鲍MSTN基因SNP位点g909CT 3种基因型中,TC和CC基因型的基因表达量显著高于TT基因型(P(27)0.05)。研究结果表明MSTN基因SNP位点可作为九孔鲍标记辅助选择育种重要候选标记。4、九孔鲍BMP-2基因多态性及与生长相关性分析实验采用PCR产物直接测序的方法在九孔鲍BMP-2基因中共筛选出了4个SNP位点,开放阅读框2个SNP位点为g1176GA、g1275CT;3′非编码区2个SNP位点为g1436GT、g1506GT,4个SNP位点的期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)分别在0.1287-0.3895和0.1713-0.4762间,多态信息含量(PIC)的范围为0.1560-0.3615。研究结果表明九孔鲍实验的群体为中度遗传多样性,在九孔鲍BMP-2基因筛选到4个SNP位点,为九孔鲍标记辅助选择育种提供参考资料。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

氨基酸序列,九孔鲍,三级结构,二级结构

182.2.2 MSTN 基因同源性及系统进化分析运用 NCBI 在线 Blastx 比对，结果表明：九孔鲍 MSTN 氨基酸序列与红鲍(Haliotisrufescens)相似性最高，为 76%，与其他物种相似性较低。基于 NJ 法构建 MSTN 氨基酸序列系统进化树，结果显示：所有鱼类和无脊椎动物先聚类随后聚在一起形成一簇，哺乳动物单独聚类为一簇。在无脊椎动物中，九孔鲍、红鲍、虾夷扇贝；凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)、墨吉明对虾(Fenneropenaeusmerguiensis)；瘤背石磺(Onchidium struma)、缢蛏(Sinonovacula constricta)、合浦珠母贝 (Pinctada martens)、紫扇贝(Argopecten purpuratus)；各聚为一支(图 2-3)。图 2-2b 九孔鲍 MSTN 基因预测二级结构(A）、三级结构(B)和结构域(C)Fig .2-2b The prediction of MSTN secondary structure(A) and tertiary structure(B) and structuraldomain(C) H. diversicolor supertexta

氨基酸序列,下划线,前肽,蛋白酶水解

28图 3-2 BMP-2 氨基酸序列比对蛋白酶水解位点(RXXR），单下划线标注 TGF-β 前肽区域，双下划线标注成熟区域ultiple sequences alignment of BMP-2 amino acid squences from differentspeciescessing site(RXXR）are show in the boxed，the predicted TGF-β prepetide domain and TGF-βomain are show in single underline and double underline respectively

氨基酸序列,系统进化树,氨基酸序列,九孔鲍

3.2.3 BMP-2 基因表达分析通过荧光定量 PCR 分析 HS-BMP-2 基因在各组织和显示：BMP-2 基因在九孔鲍 6 个组织中均有表达，在足中高表达，在性腺、鳃中低表达(P<0.05) (图 3-5a)；在检BMP-2 基因在九孔鲍受精卵时期表达量最高，其次是受胚、稚鲍时期，在卵、幼鲍时期表达量最低(P<0.05) (图图 3-4 基于 NJ 法构建 BMP-2 氨基酸序列系Fig.3-4 Phylogenetic tree of BMP-2 was constructed usingmethod50100bbbb量expressionn

【参考文献】