黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA在毕赤酵母中异源表达

发布时间：2020-09-29 16:36

　　 [目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。
【部分图文】：

A在毕赤酵母中异源表达1．2．6重组CBHA酶特性研究使用羧甲基纤维素钠(CMC－Na)为底物进行CBHA酶活力的测定［20］。酵母重组子经甲醇诱导进行摇瓶发酵，每24h补加1%的甲醇，发酵液离心后上清液作为粗酶液，在不同的发酵时间测定粗酶液的CMC酶活力。分别在不同pH(1．5～7．5)和不同温度(30～70℃)条件下，测定重组CBHA酶的CMC酶活力。2结果与分析2．1黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因的克隆及序列分析以提取得到的黑曲霉基因组DNA为模板，按方法1．3所述克隆得到黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因序列，电泳结果如图1显示在1500bp左右获得一条明亮条带，条带长度与预期设计的大小吻合(黑曲霉cbhA序列全长1514bp)。扩增得到的cb-hA基因序列已经提交NCBIGenBank，编号为KT886077。预测氨基酸序列452aa，通过ComputepI/Mw在线预测，该蛋白质等电点为4．20，分子量为48．3kDa。在Uniprot网站上在线比对该氨基酸序列，与A．niger的Glucanase(由cbhⅠ基因编码，UniprotNo．F2YWN5)高度同源，相似度达到98．9%，该蛋白属于糖基水解酶第7家族(GH7fam-ily)，氨基酸序列同源性比对结果见图2。另外，该序列与Aspergilluskawachii的Glucanase(G7XEI8)亲源关系较近近，相似度为97．8%;而与Aspergillusni-ger的cellobiohydrolaseA(A2QPG2)的相似度为94．2%。通过SWISS－MODEL在线预测该蛋白质的三级结构，结果显示CBHA与CBHⅠ的催化结构域(CatalyticDomin，CD域)相似度为72．06%，图3所示为预测的CBHA三级结构模型。图1黑曲霉cbhA基因的PCＲ扩增电泳图Fig．1ThePCＲamplificationelectrophoresisofcbhAfromAspergillusniger2．2含cbhA基因的毕赤酵母载体的构建及鉴定按照1．2．2中所述方法，对cbhA基因表达载体的进行构建和测序验证?

得到黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因序列，电泳结果如图1显示在1500bp左右获得一条明亮条带，条带长度与预期设计的大小吻合(黑曲霉cbhA序列全长1514bp)。扩增得到的cb-hA基因序列已经提交NCBIGenBank，编号为KT886077。预测氨基酸序列452aa，通过ComputepI/Mw在线预测，该蛋白质等电点为4．20，分子量为48．3kDa。在Uniprot网站上在线比对该氨基酸序列，与A．niger的Glucanase(由cbhⅠ基因编码，UniprotNo．F2YWN5)高度同源，相似度达到98．9%，该蛋白属于糖基水解酶第7家族(GH7fam-ily)，氨基酸序列同源性比对结果见图2。另外，该序列与Aspergilluskawachii的Glucanase(G7XEI8)亲源关系较近近，相似度为97．8%;而与Aspergillusni-ger的cellobiohydrolaseA(A2QPG2)的相似度为94．2%。通过SWISS－MODEL在线预测该蛋白质的三级结构，结果显示CBHA与CBHⅠ的催化结构域(CatalyticDomin，CD域)相似度为72．06%，图3所示为预测的CBHA三级结构模型。图1黑曲霉cbhA基因的PCＲ扩增电泳图Fig．1ThePCＲamplificationelectrophoresisofcbhAfromAspergillusniger2．2含cbhA基因的毕赤酵母载体的构建及鉴定按照1．2．2中所述方法，对cbhA基因表达载体的进行构建和测序验证。本实验设计的是单酶切位点连入载体，而只有同pPIC9K载体的启动子序列正向连接的序列才可以正确表达。结果如图4所示，1为正向连接的pPIC9K－cbhA质粒经BamHⅠ酶切得到9．431kb和1．33kb两个片段，用于后续实验。图2基于氨基酸序列构建的系统发育树Fig．2Phylogenetictreebasedontheaminoacidsequencesofthecellobiohydolases2．3重组毕赤酵母的筛选和鉴定用无菌水洗脱MD平板上长出的转化子，将其均匀涂布在含不同G418浓度的YPD－G418平板上。pPIC9K整合入毕赤酵母

生物技术2017年图3CBHA三级结构预测图Fig．3Thepredicted3－DimensionalstructureoftheCBHAenzyme图4重组pPIC9K－cbhA质粒经BamHⅠ酶切电泳图Fig．4TheBamHⅠenzymedigestionspectrumofrecombinantplasmidpPIC9K－cbhA菌浓，并取出10mL发酵液，离心后上清液作为粗酶液，测定其CMC酶活力。如图5所示，为重组酵母转化子P．pastoris/cbhA的CMC酶活力时间曲线及菌体生长情况，从图中可以看出，在84h之内，经过甘油饥饿培养，进入以甲醇为唯一碳源的诱导培养阶段后，菌体量仍呈上升趋势，CMC酶活力也一直处于上升趋势，在60h以内CMC酶活力上升的趋势较平缓，到60h和84h的时候，蛋白表达量明显提高。与含有空载体的酵母菌相比，携有cbhA基因的工程菌株与携有pPIC9K质粒菌株相比，CMC酶活性提高250%。图5重组毕赤酵母菌株的产酶时间曲线■菌株P．pastoris/pPIC9K－cbhA与P．pastoris/pPIC9K酵母CMC酶活力比值;◆菌体生长量。Fig．5ThetimecourseoftherelativeCMCactivityproducedbytheengineeredP．pastorisstrain■TherelativeCMCactivityratioofP．pastoris/pPIC9K－cbhAandP．pastoris/pPIC9K;◆bacteriagrowthmass．2．5表达产物的SDS－PAGE分析发酵液经硫酸铵浓缩和透析除盐后，将获得的浓缩粗酶液进行SDS－PAGE分析，CBHA预测蛋白分子量为48．3kDa。结果如图6所示，箭头所指位置在45kDa条带上方有1条明显的特异性蛋白条带(图中标记为2)，而阴性对照pPIC9K/GS115(图中标记为1)诱导上清中在该区域没有蛋白条带，证明目的基因得到成功表达。图6重组cbhA基因在毕赤酵母中的表达1:携有pPIC9K的酵母转化子;2:携有pPIC9K－cbhA的酵母转化子;箭头所示为重组蛋白CBHA。Fig．6SDS－PAGEanalysisoftherecombinantCBHAinP．p

本文编号：2829977