火龙果淹水胁迫的生理生化与基因差异表达研究

发布时间：2020-09-29 19:40

　　火龙果(Hylocereus undatus)是一种营养丰富,富含多种有益物质的仙人掌科量天尺属植物。海南地区因其光照与气候条件的优势,尤为适宜火龙果的种植,然而每年的5月至11月是海南地区台风多发的季节,而台风等因素会导致洪涝灾害的发生,进而导致土壤含水量增高,当含水量超过田间持水量时就会造成火龙果的淹水胁迫,影响火龙果的正常生长发育,不利于火龙果生产。因此,本研究以火龙果品种“台湾大红”为遗传材料,一方面对其进行淹水胁迫处理,在不同的淹水时间取样,测定与淹水胁迫相关的SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、叶绿素含量、根系活力等7项生理生化指标以及其形态学指标,进行不同淹水胁迫不同时长的样品之间的差异比较及动态分析,探索淹水胁迫对火龙果的宏观影响；另一方面运用新一代高通量RNA-Seq测序技术进行转录组测序,构建不同淹水时长样品的数字表达谱,通过生物信息学的分析比较研究,筛选出与淹水胁迫相关的差异表达基因,克隆对淹水胁迫响应相关的重要基因,探究火龙果对淹水胁迫响应的调控机制。研究结果如下:1、火龙果苗的不定根在胁迫0～10 d显著变短,须根在淹水胁迫30 d时明显减少;侧茎在胁迫30～40 d开始出现褶皱,发生萎蔫;主茎基部在胁迫30～40d开始出现病斑,40～50 d开始腐烂,表明火龙果扦插苗对淹水胁迫有一定的耐受性,淹水生境对火龙果产生的影响最先作用于其根系。2、淹水胁迫后,火龙果的SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、Pro含量显著增加,叶绿素含量基本保持不变,根系活力显著降低,表明火龙果能够通过调节其体内某些生理物质来抵御逆境对其产生的影响,增强火龙果对淹水胁迫的抗性。3、通过RNA-Seq测序,未经淹水胁迫处理的火龙果根系样本CK1、CK2、CK3淹水胁迫3 h后的火龙果根系样本FR1、FR2、FR3分别获得的clean reads条数为66469530(89.15%)、66858484(89.59%)、66364154(88.87%)、66947570(89.70%)、66976684(89.73%)、63525616(89.59%)条。经组装、聚类去冗余后分别获得26466、25983、25780、26331、29186、23138 个 Unigenes,分别占 50.20%,49.29%,48.90%,49.95%,55.36%,43.89%。其平均长度为 731.26 bp,N50 为 1792。4、通过与 Nr、Nt、GO、KOG、KEGG、SwissPprot 和 InterPro 七大数据库比对上的 Unigene 数分别为 71.43%,46.00%,41.03%,57.00%,53.43%,48.55%,61.37%。其中,被七大数据库中所有数据库注释上的Unigene总数及比例分别为11357和21.54%。被七大数据库中任意一个数据库注释上的Unigene总数及比例分别为39239和74.43%。在Nr、KOG、KEGG、SwissProt以及InterPro五大数据库中均被注释到的有19763个Unigene基因。比对KOG数据库得25个功能组,涉及一般功能预测的蛋白数量最多,涉及信号传导机制的次之;与GO数据库比对,其功能分布主要富集于新陈代谢途径和催化活性。5、将FR组与CK组的基因的表达量进行差异比较分析,当差异倍数为2时,共有1481个差异表达基因,其中有925个基因上调,556个基因下调;当所选取的基因表达量差异倍数为3时,共有965个差异表达基因,其中有637个基因上调,328个基因下调;当基因表达量差异倍数为4时,共有535个差异表达基因,其中有379个基因上调,156个基因下调,其功能大多集中于糖代谢、氮代谢、乙醇代谢等方面。此外,一些能够编码转录因子以及一些与激素相关的基因在不同处理间的表达量差异也较为明显。6、通过FR组与CK组火龙果中的差异表达基因GO富集分析,可知差异表达基因富集在代谢途径中的single-organism metabolic process和催化活性中的pyruvate decarboxylase activity、thiamine pyrophosphate binding 等方面。通过差异表达基因pathway富集分析,可知差异表达基因富集在phenylalanine代谢,stilbenoid、diarylheptanoid and gingerol 生物合成、ubiquinone and other terpenoid-quinone 生物合成等途径,与能量代谢、氨基酸生物合成、乙烯代谢、ROS代谢等代谢途径、次生代谢物合成以及与衰老相关的差异表达基因数较多,表明这些差异表达基因很有可能与植物淹水胁迫下的应答机制有关。7、据预测,具有编码TF能力的Unigene有1600个,其中MYB、MYB-related、WRKY、AP2-EREBP、bHLH家族的转录因子较多,分别为190、149、100、125、117个,NAC和C3H家族的TF分别为70和88个。当差异表达基因的差异倍数为4时,差异表达基因中编码WRKY、MADS、bHLH、AP2-EREBP等TF的基因数较多,这些TF可能参与了火龙果应对淹水逆境所形成的调控网络。8、结合相关报道、生理指标数据以及KEGG数据库分析结果,挑选出26个可能与淹水胁迫相关的酶的Unigenes进行qRT-PCR验证,结果表明测序结果与预测结果相符,并挑选出 Glucose-6-phosphateisomerase、Ribosome-bindingATPaseYchF、Ethylene-responsive transcription factor 1B、Ethylene receptor 2、Ethylene insensitive 3、Cytochrome P450 87A3、LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase FLS2、Squalene synthetase、WRKY transcription factor 3等可能对淹水胁迫敏感的基因准备进行深入挖掘与研究。9、选取了 Unigene15627_A11和CL2218.Contigl_A11两个在植物淹水胁迫中表达差异较为显著的,且与淹水胁迫密切相关的基因进行了生物信息学分析,以为后续研究提供理论依据。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S667.9
【部分图文】：

图２。逡逑ｒｅａｄｓ邋过滤，获得邋ｃｌｅａｎ邋ｒｅａｄｓ。逡逑

流程图,信息分析,转录组,测序

Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑（２）信息分析流程逡逑分析过程如下，完整的分析流程图见图２。逡逑①ｒｅａｄｓ邋过滤，获得邋ｃｌｅａｎ邋ｒｅａｄｓ。逡逑②对ｃｌｅａｎ邋ｒｅａｄｓ进行组装得到Ｕｎｉｇｅｎｅ。逡逑③对Ｕｎｉｇｅｎｅ进行功能注释、ＳＳＲ检测。逡逑④计算每个样品Ｕｎｉｇｅｎｅ表达水平。逡逑⑤差异表达基因的检测及深入分析。逡逑１７逡逑

功能注释,组装过程,聚类,基因家族

Ｕｎｉｇｅｎｅ分为两部分，一部分是ｃｌｕｓｔｅｒｓ，是进一步聚类去冗余后的结果，以ＣＬ逡逑开头后面接基因家族的编号。其余的是ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ，指没有聚类、单独的Ｕｎｉｇｅｎｅ，以逡逑Ｕｎｉｇｅｎｅ开头。组装流程见

【参考文献】