蓝莓果实成熟相关miRNA及其靶标的鉴定与VcMIR156基因的遗传转化

发布时间：2020-09-29 19:55

　　 蓝莓(Vaccinium spp.)是一种经济价值较高的越橘类浆果,其果实鲜食甘甜、营养丰富,尤其是果实中富含的花青苷对人体健康有诸多益处。因此挖掘蓝莓果实发育调控因子并利用分子遗传手段针对性的进行品种改良或培育蓝莓新品种不仅具有重要的经济意义,而且在人类健康方面具有重要的社会意义。miRNA是一类长度为18-24nt的内源非编码RNA,是调控基因表达的重要作用因子,在果实发育和成熟过程中扮演重要角色。然而目前关于蓝莓miRNA方面的研究还少有报道。本研究利用小RNA测序和降解组测序技术对蓝莓果实发育的两个关键时期(白熟期和蓝熟期)的miRNA及其靶标进行鉴定,并构建了miRNA介导蓝莓果实发育的调控网络。进一步利用蓝莓转化体系成功的将蓝莓VcMIR156基因转入到蓝莓中,为深入研究该MIR基因的功能奠定了基础。具体研究结果如下:1.构建了蓝莓果实白熟期和成熟期sRNA测序文库和降解组测序文库,在sRNA测序文库中鉴定了100个miRNA。其中包括来自28个miRNA家族的84个已知miRNA和16个新的miRNA。我们挑选从测序结果中挑选16个miRNA用stem-loop qPCR方法进行验证,stem-loop qPCR结果与sRNA测序结果基因表达趋势基本一致;降解组测序共鉴定了41个已知miRNA和7个新miRNA的178个靶标。用RLM-RACE对蓝莓miR160的两个靶标进行检测,从而验证了降解组测序的准确性。2.为了探究蓝莓中已知miRNA的保守性,我们从NCBI下载葡萄成熟miRNA和pre-miRNA的序列并与蓝莓sRNA测序得到的数据一起构建了进化树,结果表明蓝莓中的miRNA与葡萄中的miRNA亲缘关系较近,蓝莓已知miRNA的保守性很高。3.为了探究蓝莓miRNA在蓝莓果实发育中的作用,对测到的100个miRNA根据其表达量进行聚类分析,发现蓝熟期与白熟期相比,共68个miRNA上调表达,推测这些miRNA可能在蓝莓果实的发育和成熟过程中发挥作用。4.利用stem-loop qPCR和qRT-PCR方法分析了6个miRNA和其靶基因在蓝莓果实发育的不同时期的表达模式,结果显示这6个mi RNA和它们的靶基因表达模式呈负相关,表明这6个miRNA通过负向调控它们的靶标,实现对蓝莓果实的发育和成熟的调控作用。5.GO分析发现miRNA的靶基因参与了生物学进程(biologic process)、细胞组分(cellular component和分子功能(molecular function)等过程。6.成功将VcMIR156通过农杆菌介导的方法在蓝莓中进行过量表达,PCR结果证明VcMIR156已经被成功转到蓝莓基因组中。qRT-PCR结果表明与野生型蓝莓相比,转基因蓝莓中蓝莓pre-miR156的表达量明显升高,而VcMIR156的6个靶基因在转基因蓝莓中表达量显著降低,由此证明我们转入的基因可以正常表达,并行使功能。这些研究结果不仅为全面理解蓝莓果实成熟调控网络提供新思路,而且为蓝莓miRNAs的功能研究奠定了基础。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S663.9
【部分图文】：

iRNA起源于基因间隔区的非编码区域，在级转录本（pri-miRNA），pri-miRNA 具结构[8,9]。之后 pri-miRNA 经 DCL1 酶（NASTIC LEAVES1），C2H2 锌脂蛋白BC 协同作用下形成具有发卡结构的 pre-A极不稳定，进一步被DCL1和HYL1切。随后，在 miRNA 甲基转移酶 HEN1（最后一个核苷酸发生甲基化以提高其稳定A*复合体依赖 HASTY 转运体从细胞核NA：miRNA*复合体中 miRNA 链选择性，形成 miR-RISC 复合体，并进行靶基NA*链随后被降解[12]。

苷生物合成途径大体相同，但中间产物和反应底物存在飞燕草素，而在牵牛花中不能形成天竺葵素成分也存在差异，这些都是由于基因选择性表达苷的前体都是丙二酰-COA。植物体内花青苷生物段：首先苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（PAL）的酸羟化酶（CH4）作用下合成 4-香豆酰 COA，随后合成酶的催化下合成查尔酮，经黄烷酮-3-羟化酶，此过程在花青苷和成过程中起到关键作用[23]。（DFR）将二羟黄酮醇还原为无色飞燕草素，无无色原花青苷素；之后原花青苷素在花青苷糖基转基化，甲基化，羟基化修饰等，此过程在内质网移酶（GST）协同作用下将花青苷转运到液泡。

图 2.1 不同长度的 miRNA 在两个文库中的 reads 数Fig.2.1 Reads numbers of miRNAs in different lengths in two libraries为了进一步发掘蓝莓 miRNA 的功能，我们也构建了蓝莓果实白熟期和成熟期降解组文库，最终在这两个文库中依此测得10686450和13702581个raw reads。大约4.49M和4.96M条序列可以匹配到蓝莓参考序列中（蓝莓转录组数据和EST是数据库），其中超过 55%测得的序列可以匹配到蓝莓 cDNA 数据库（表 2.6）。

【参考文献】

相关期刊论文 前7条

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1 王静;红豆越橘叶片不定芽再生与VcANS基因遗传转化[D];吉林农业大学;2017年

本文编号：2830185